本发明专利技术属于烟草黑胫病检测技术领域。针对烟草黑胫病菌检测难度大的问题，本发明专利技术提供一种基因片段在检测烟草黑胫病菌中作为探针基因的应用、检测烟草黑胫病菌的PCR引物对、试剂盒及方法。探针基因如SEQ ID NO:1所示；引物对如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。提取发病烟草的基因组DNA，通过PCR克隆该特异基因，如果能克隆到目的片段，则说明是黑胫病菌侵染，如果不能克隆到目的片段，则说明不是黑胫病菌侵染。染。
【技术实现步骤摘要】
检测烟草黑胫病的探针基因、引物对、试剂盒及应用
[0001]本专利技术属于烟草黑胫病检测
，具体涉及一种检测烟草黑胫病的探针基因、引物对、试剂盒及应用。
技术介绍
[0002]烟草黑胫病是烟草上的重要根茎病害，给烟草生产造成巨大损失。在大田中烟草上的根部病害主要有黑胫病、青枯病、根黑腐病等。其中黑胫病属于卵菌病害，青枯病属于细菌病害，根黑腐病属于真菌病害。由于这几种病害的症状相似，难于辨别，给病害防治造成很大困难。传统的病害鉴定常以生物学鉴定为主，过程复杂，准确度差。本专利技术运用分子生物学技术对对田间黑胫病进行鉴定，提高了病害鉴定的准确性和效率。
技术实现思路
[0003]针对烟草黑胫病菌检测难度较大的上述问题，本专利技术提供一个基因片段在检测烟草黑胫病菌中作为探针基因的应用、检测烟草黑胫病菌的PCR引物对、试剂盒及方法。本专利技术的目的基因只在黑胫病菌基因组内存在，可以作为检测黑胫病的探针基因；根据目的基因序列设计引物，提取发病烟草的基因组DNA，通过PCR克隆该特异基因，如果能克隆到目的片段，则说明是黑胫病菌侵染，如果不能克隆到目的片段，则说明不是黑胫病菌侵染。
[0004]本专利技术是通过以下步骤实现的：
[0005]一个基因片段在检测烟草黑胫病菌中作为探针基因的应用，所述基因片段如SEQ ID NO:1所示。
[0006]本专利技术还提供一种检测烟草黑胫病菌的PCR引物对，其正向引物序列如SEQ ID NO:2所示；反向引物序列如SEQ ID NO:3所示。r/>[0007]本专利技术还提供一种检测烟草黑胫病菌的试剂盒，包括权利要求2所述的引物对。
[0008]进一步的，所述试剂盒还还包括Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs和ddH2O。
[0009]本专利技术还提供一种检测烟草黑胫病菌的方法：从烟草植株上刮取发病组织，提取DNA，以所提取的DNA为模板，利用权利要求2所述的引物对进行PCR扩增，并将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，若出现540bpDNA条带，则待测样本为烟草黑胫病菌。
[0010]进一步的，上述方法的PCR扩增反应条件为：94℃变性1min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保温。
[0011]本专利技术通过烟草黑胫病菌一个特异基因(SEQ ID NO:1)可以有效鉴别黑胫病菌，该基因只在黑胫病菌中表达，青枯病和根黑腐病菌基因组里都不包含该基因。
[0012]本专利技术的引物对的扩增特异性好，扩增产物干净杂带少，电泳检测时间短，条带清晰好判断。
附图说明
[0013]图1为探针基因在不同物种基因组DNA中的检测情况，1
‑
烟草黑胫病菌；2
‑
烟草青
枯病菌；3
‑
烟草根黑腐病菌；4
‑
烟草品种K326；5
‑
烟草品种革新3号；6
‑
烟草花叶病毒(TMV，侵染烟草，引起花叶病毒病)；7
‑
黄瓜花叶病毒(CMV，侵染烟草，引起花叶病毒病)；
[0014]图2为应用例PCR检测结果。
具体实施方式
[0015]下面结合具体实施例及附图对本专利技术做进一步详细说明。
[0016]实施例
[0017](一)实验所用材料
[0018]烟草黑胫病菌，烟草青枯病菌，烟草根黑腐病菌，烟草品种K326，烟草品种革新3号，烟草TMV，烟草CMV
[0019](二)实验所用试剂和仪器
[0020]北京全式金公司真菌DNA提取试剂盒、北京全式金公司细菌DNA提取试剂盒、北京全式金公司植物DNA提取试剂盒、10
×
PCR Buffer、dNTP Mix、PCR polymorase、loading buffer、DNA marker、移液器(0.1μl
‑
1000μl)、Eppendorf台式离心机、Milli
‑
Q超纯水机、GRANT SUB Aqua Plus数字控温水浴锅、SANYO SIM
‑
F140 AY65制冰机和TOMY SS
‑
325自动灭菌锅、Applied Biosystems的Veriti
TM
多重控温PCR仪、BIO
‑
RAD电泳槽及电压仪、普通冰箱等。
[0021](三)目的基因HJR1204的序列(SEQ ID NO:1)：
[0022]ATGCGGTTTTACTACACCCTGCTTGCAACTGTAGCCGCACTTCTGGTCCACAGCAATGCTTTACCGGCAGCGGCAGAAACTAGCCTGAACCAGTTGACAGCAGTCGATGGGGCCACCACCACGAGTCAGCGCTTTTTACGTCGACACATCGATTCGGAAACTACGGACAACGAGGAACGGCTTAACTCGGGCCCCATCGTCCTCGATACCGCTAAGAAGATCGACGACTTATTCGAAGTCGAAAAGCTCGACAAAATTCTCGACCCCAAAATGGCCGACAAATTCCTGGATGGGAAGACGTTTTTTGGCTGGTTGGATAAGAGCGCACTTGATGAGGCCCTTAACGGGAACATCGCCCAGAAGACGAAAGTTTTCGAGCATTGGCGTGAGAAAAGATTGAGACCGAAGGCGTTAACCAAGGTCCTCACAACCGATCCCGCCGTAAGAAAGAAGTACAAGTTTGTCTACGAAATGTACGACAGCTACATCAAATACGTAGCACGGAAAAAACTTTCTGGTCTTAAGAGAAACAGAGGTGACTAG
[0023]步骤1：设计引物如下：
[0024]5′
引物：5
’
ATGCGGTTTTACTACACCCT 3
’
(SEQ ID NO:2)；
[0025]3′
引物：5
’
CTAGTCACCTCTGTTTCTCT 3
’
(SEQ ID NO:3)。
[0026]步骤2、烟草黑胫病菌基因组DNA的提取
[0027]刮取燕麦培养基上培养14天的烟草黑胫病菌菌丝，利用北京索莱宝公司真菌DNA提取试剂盒提取烟草黑胫病DNA。具体步骤如下：
[0028]1、样品的处理：取50
‑
100mg烟草黑胫病菌菌丝，倒入适量的液氮，立即研磨重复3次，使样品研成粉末，加200ul溶液A，加入20ul RNase A，再加入100mg玻璃珠，在高速振荡器上振荡，约5min。
[0029]2、加入20ul 10mg/ml的蛋白酶K，充分混匀，55℃水浴消化，30min。消化期间可颠倒离心管混匀数次，12000rpm离心2min本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一个基因片段在检测烟草黑胫病菌中作为探针基因的应用，其特征在于，所述基因片段如SEQ ID NO:1所示。2.一种检测烟草黑胫病菌的PCR引物对，其特征在于，正向引物序列如SEQ ID NO:2所示；反向引物序列如SEQ ID NO:3所示。3.一种检测烟草黑胫病菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的引物对。4.一种检测烟草黑胫病菌的试剂盒，其特征在于，还包括Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs和ddH2...
【专利技术属性】
技术研发人员：王文静，王晓强，王凤龙，任广伟，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所中国烟草总公司青州烟草研究所，
类型：发明
国别省市：
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