一种检测耶氏肺孢子菌及其耐药突变的引物探针组合及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种检测耶氏肺孢子菌及其耐药突变的引物探针组合及其应用，所述检测耶氏肺孢子菌及其耐药突变的引物探针组合包括扩增并检测二氢叶酸合成酶基因的引物对和探针；扩增所述二氢叶酸合成酶基因的引物对包括SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列，检测所述二氢叶酸合成酶基因的探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。本发明专利技术还提供了一种检测耶氏肺孢子菌及其耐药突变的试剂盒及其以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法以及一种检测耶氏肺孢子菌及其耐药突变的装置。所述引物探针组合特异性好，灵敏度高，所述试剂盒设计合理，使用方便，应用前景广阔。应用前景广阔。应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
一种检测耶氏肺孢子菌及其耐药突变的引物探针组合及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，尤其涉及一种检测耶氏肺孢子菌及其耐药突变的引物探针组合及其应用。

技术介绍

[0002]肺孢子菌(Pneumocystis)为单细胞生物，长期以来被划归为原虫，称为卡氏肺孢子(囊)虫。1942年，Jiroveci等人首次从肺炎患者的肺组织中分离到该病原体。1988年通过对其核糖体小亚基rRNA的序列分析证实其属于真菌，更名为肺孢子菌。根据相关研究发现，感染人类与不同动物的肺孢子菌之间各不相同，感染人类的被命名为耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jiroveci，PJ)，由肺孢子菌导致的疾病称为肺孢子菌病(Pneumocystis pneumonia)。
[0003]耶氏肺孢子菌是一种机会性致病菌，可导致严重的耶氏肺孢子菌肺炎(Pneumocystis Pneumonia，PCP)，多见于艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)患者等免疫功能低下及其他免疫功能缺陷人群。据统计，艾滋病患者合并感染耶氏肺孢子菌肺炎的概率高达70％～80％，如果不治疗，死亡率高达100％。近年来，随着广谱抗生素、皮质类固醇激素及免疫抑制剂的普遍应用，以及糖尿病患者、艾滋病患者的增多等，为条件致病真菌的繁殖和致病提供了良好的条件，耶氏肺孢子菌肺炎感染的发病率有明显增加的趋势。
[0004]耶氏肺孢子菌肺炎感染的诊断面临很多困难，PCP缺乏特异性的临床症状，病原学检测是PCP确诊的唯一证据，但耶氏肺孢子菌不能进行体外培养，一般采取染色方法进行诊断，但所用的样本一般为肺组织或肺泡灌洗液(BALF)，这就需要有创取材，很大程度上限制了该方法的应用；血清学检测假阳性率高，特异性低；也有通过分子生物学手段进行检测的方法，但其仅能检测是否为耶氏肺孢子菌感染，不能对耶氏肺孢子菌及其耐药性突变进行区分，且其检测方法比较繁琐，使用多对引物探针，检测成本较高。
[0005]因此，如何提供一种耶氏肺孢子菌的检测方法，可以检测样本是否感染了耶氏肺孢子菌，并对其耐药突变类型进行区分，已成为亟待解决的问题。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种检测耶氏肺孢子菌及其耐药突变的引物探针组合及其应用，利用荧光探针结合熔解曲线法的不对称PCR法，可以在一次反应中判断样本是否感染了耶氏肺孢子菌及其对磺胺类药物的耐药突变情况，检测效率高，应用前景广阔。
[0007]为达此目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供了一种检测耶氏肺孢子菌及其耐药突变的引物探针组合，所述检测耶氏肺孢子菌及其耐药突变的引物探针组合包括扩增并检测二氢叶酸合成酶基
因的引物对和探针；
[0009]扩增所述二氢叶酸合成酶基因的引物对包括SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列，检测所述二氢叶酸合成酶基因的探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
[0010]SEQ ID No.1：ATTAATGGATGTGGAGAATTT；
[0011]SEQ ID No.2：TTTTATAGCAGGAATAACTCG；
[0012]SEQ ID No.3：TGGGCAGTCTGCACGGTCTGGTT。
[0013]本专利技术中，仅使用一对引物探针，可以对样本中的耶氏肺孢子菌进行检测，并对野生型W及三种突变即双位点突变M、单位点突变MG(T55A)以及单位点突变MT(P57S)全部进行区分，用时极短，检测效率高；选择二氢叶酸合成酶(DHPS)作为靶基因，具有较高的敏感性和特异性，且操作简单，检测成本较低。
[0014]本专利技术中，耶氏肺孢子菌的野生型序列如SEQ ID No.7所示，突变型序列如SEQ ID No.8所示。
[0015]SEQ ID No.7：
[0016]agttctgaattttataaagcgcctacacatattatggccattttaaatcttactcctgattcttttttcgatgggggtgttcattcatatgattctatattaatggatgtggagaattttataaatgcaggggcgacgataattgatattggtgggcagtctacacggcctggttcacatgttgtttctatagaggaagagatttctcgagttattcctgctataaaatatctcttaaaagtatatcctgatattttagtaagtgtagatacttttcgttctgaggttgcagaacaagcaattaaggctggtgctagtcttgttaatgatataagtgggggaaggtatgatccaaaaatgcttaatgtggttgccaagttgaaagttccaatatgtataatgcatatgagaggtgattttttaactatggacaatttaactgattatggtaccgatattataaaacaaattactaaagaattagaagaattgcttgtttttgctgaaagttcgggtatttttaggtggaatattattttagatcctgggttaggatttgctaaaacttcctatcaaaatatagaattgttaagaagatttaatgaattaaaatctcagcattgctttaatggtttgccttggttgcttggtccaagtcgcaaaagatttacagggtgtcttacaggtgatgttatgccaaaagataggatttggggcactgctgcttcggttgccgcatctgttttaggaggctgtgatattatacgggttcatgatgtttatgaaatgtataaagtttcaagaactttggatgctatttggaaagaaatttattaa。
[0017]SEQ ID No.8：
[0018]agttctgaattttataaagcgcctacacatattatggccattttaaatcttactcctgattcttttttcgatgggggtgttcattcatatgattctatattaatggatgtggagaattttataaatgcaggggcgacgataattgatattggtgggcagtctgcacggtctggttcacatgttgtttctatagaggaagagatttctcgagttattcctgctataaaatatctcttaaaagtatatcctgatattttagtaagtgtagatacttttcgttctgaggttgcagaacaagcaattaaggctggtgctagtcttgttaatgatataagtgggggaaggtatgatccaaaaatgcttaatgtggttgccaagttgaaagttccaatatgtataatgcatatgagaggtgattttttaacta本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测耶氏肺孢子菌及其耐药突变的引物探针组合，其特征在于，所述检测耶氏肺孢子菌及其耐药突变的引物探针组合包括扩增并检测二氢叶酸合成酶基因的引物对和探针；扩增所述二氢叶酸合成酶基因的引物对包括SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列，检测所述二氢叶酸合成酶基因的探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的检测耶氏肺孢子菌及其耐药突变的引物探针组合，其特征在于，所述检测耶氏肺孢子菌及其耐药突变的引物探针组合还包括扩增并检测内标基因的引物对和探针。3.根据权利要求2所述的检测耶氏肺孢子菌及其耐药突变的引物探针组合，其特征在于，扩增所述内标基因的引物对包括SEQ ID No.4～5所示的核苷酸序列，检测所述内标基因的探针包括SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。4.根据权利要求1～3任一项所述的检测耶氏肺孢子菌及其耐药突变的引物探针组合，其特征在于，所述探针携带荧光基团和淬灭基团；优选地，所述荧光基团包括ALEX
‑
350、Alexa Fluor 488、CY3、FAM、VIC、TET、CALGold540、JOE、HEX、CALFluorOrange560、TAMRA、CALFluorRed590、ROX、CALFluorRed610、TexasRed、CALFluorRed635、Quasar670、CY5、CY5.5、LC RED640或Quasar705中的任意一种；优选地，所述淬灭基团包括TAMRA、DABCYL、BHQ
‑
1、BHQ
‑
2、BHQ
‑
3或Eclipse中的任意一种。5.一种检测耶氏肺孢子菌及其耐药突变的试剂盒，其特征在于，所述检测耶氏肺孢子菌及其耐药突变的试剂盒包括权利要求1～4任一项所述的检测耶氏肺孢子菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：阎香言，王志贤，张傲，白雪秋，李姝丽，吴秀祯，盛长忠，粟艳，周泽奇，
申请(专利权)人：丹娜天津生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：