一种基于靶向测序的枸杞S基因的快速分型鉴定方法技术

本发明专利技术涉及一种基于靶向测序的枸杞S基因的快速分型鉴定方法，依据若干参考枸杞品种的S基因设计探针，利用设计的探针组合物对待测枸杞样品的基因进行杂交捕获、测序分析，并将测序结果与参考枸杞品种的S基因进行比对，判断待测枸杞样品的S基因与所述参考枸杞品种的S基因是否匹配，确定待测枸杞样品S基因所匹配的参考枸杞品种。本发明专利技术针对多个待测SNP位点设计特异性扩增引物，利用靶向测序分型(GBTS)技术，实现枸杞S

【技术实现步骤摘要】
一种基于靶向测序的枸杞S基因的快速分型鉴定方法


[0001]本专利技术属于分子植物育种领域，具体涉及一种基于靶向测序的枸杞S基因的快速分型鉴定方法。

技术介绍

[0002]枸杞(Lycium barbarum L.)属于茄科枸杞属，是一种经济效益高，用途广泛的特种经济作物。枸杞属植物存在广泛的自交不亲和，其亲和性特征对枸杞的丰产稳产会产生巨大的影响。枸杞属植物自交不亲和性状主要由S
‑
RNase(S)基因控制，绝大多数无性系具有两种基因型，同型组配表现为自交不亲和。准确了解种质S基因有助于指导育种工作实践和授粉树配置，避免因自交不亲和无法正常结实的问题。传统S
‑
RNase(S)基因型的鉴定主要通过杂交授粉试验、DNA测序及固态芯片检测几种方法来实现的，其中，
[0003]传统田间杂交授粉试验的试验方法如下：应用不同品种之间的田间“杂交授粉试验”，用杂交后座果率来判断各品种所携带的S基因和品种的S基因型。即杂交后座果率来判断各品种所携带的S基因和品种的S基因型，是早期研究品种间杂交亲和的唯一方法。该方法具有直观性和可操作性的优点，但是当双亲或一个亲本的S基因型未知或没有适当的测试品种时，就无法确定品种的S基因型。
[0004]传统克隆测序的试验方法如下：根据保守区的序列特征设计引物，扩增出包含所有高变区的DNA序列，将测序结果利用生物信息学软件和各种网上资源对该序列进行同源性搜索和序列比较，确定待查序列的S基因种类，该方法是当前最主要的S基因分型检测手段。一个实验员大约1.5周可以完成8个种质检测，检测1000份种质约需125*1.5＝180周，约需3.5年。
[0005]传统固态芯片检测技术的试验方法如下：根据目的基因设计相应的包含于目的扩增片段的检测探针，采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量核酸片段有序地固化于芯片片基(如玻片、硅片等载体)的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器(如激光共聚焦扫描)对杂交信号的强度进行快速、并行、高效的检测分析，从而获取样品的遗传信息，确定样品的基因类型。固态芯片首次开放性成本50万元以上，发现新基因后，添加新的检测对象信息难，后期需要专业检测设备，单个样品检测成本高达100元以上。
[0006]综上，需要研发一种能够快速鉴定枸杞S基因分型的方法，缩短鉴定时间，降低鉴定成本。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种基于靶向测序的枸杞S基因的快速分型鉴定方法。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：
[0009]一种基于靶向测序的枸杞S基因快速分型鉴定，依据若干参考枸杞品种的S基因设
计探针，利用设计的探针组合物对待测枸杞样品的基因进行杂交捕获、测序分析，并将测序结果与参考枸杞品种的S基因进行比对，判断待测枸杞样品的S基因与所述参考枸杞品种的S基因是否匹配，确定待测枸杞样品S基因所匹配的参考枸杞品种。
[0010]进一步的，所述参考枸杞品种的S基因采用已知枸杞品种的S基因；若干所述参考枸杞品种的S基因如SEQIDNO:1～15所示。
[0011]进一步的，依据所述参考枸杞品种的S基因设计的探针组合物，包括50条探针序列，所述50条探针序列如SEQIDNO:16～65所示
[0012]进一步的，利用设计的探针组合物对待测枸杞样品的基因进行杂交捕获、测序分析，包括如下步骤：
[0013]步骤1、样品文库的制备：
[0014]枸杞基因组DNA经打断、末端修复、接头连接、接头产物纯化后，获得测序文库，然后进行文库扩增和文库纯化；
[0015]步骤2、探针杂交：将纯化后的文库DNA与权利要求1所述的探针组合进行杂交捕获后，洗脱去除未结合的DNA，获得杂交后的DNA；
[0016]步骤3、PCR富集
[0017]将杂交后的DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
[0018]步骤4、PCR纯化
[0019]对PCR扩增产物进行纯化；
[0020]步骤5测序
[0021]将纯化后的PCR扩增产物采用二代测序技术进行基因测序，获得待测枸杞样品S基因的测序结果；
[0022]进一步的，步骤1、样品文库的制备，包括如下步骤：
[0023]步骤1.1、对枸杞基因组DNA进行准确定量；
[0024]步骤1.2、枸杞基因组DNA通过酶切进行打断，获得DNA片段；
[0025]步骤1.3、打断的基因组DNA进行末端修复；
[0026]步骤1.4、将末端修复后的DNA片段连接上接头；
[0027]步骤1.5、将连接接头后的产物进行纯化；
[0028]步骤1.6、对连接接头的DNA进行文库扩增
[0029]步骤1.7、对扩增后的文库进行纯化，获得样品文库。
[0030]与现有技术相比，本专利技术所取得的有益效果如下：
[0031]1、本专利技术根据DNA互补原理，在每个待测位点设计一条或多条覆盖目标SNP的探针，这些用生物素(Biotin)修饰的探针可以与变性后的重测序文库中目标区域杂交形成双链，利用链霉亲和素包被的磁珠将携带有生物素的分子吸附，经过洗脱、扩增和测序最终获得目标SNP的基因型。
[0032]2、针对多个待测SNP位点设计特异性扩增引物，利用靶向测序分型(GBTS)技术，实现枸杞S
‑
RNase基因的快速分型鉴定。
[0033]3、采用本专利技术技术，多达5万个位点的检测可以在单管中同时完成，大大增加了检测通量，降低检测成本。
具体实施方式
[0034]下面结合实施例对本专利技术进行进一步的阐述。
[0035]实施例1：
[0036]一种基于靶向测序的枸杞S基因的鉴定方法，包括如下步骤：本实施例选择8份枸杞样本进行试验，8份枸杞样本分别为：Ly99
‑
01、Ly100
‑
01、Ly101
‑
01、Ly102
‑
01、Ly103
‑
01、Ly105、Ly106、Ly107；
[0037]步骤1、收集已知枸杞品种的S基因，作为参考枸杞品种的S基因，并依据参考枸杞品种的S基因序列，进行探针设计
[0038]步骤1.1、收集已知枸杞品种的S基因，作为参考枸杞品种的S基因，本实施例参考枸杞品种为15个，将这15个参考枸杞品种的S基因的DNA序列，作为转录本序列；所述15个参考枸杞品种及其S基因序列为：枸杞ID:1，其序列如SEQIDNO:1所示；枸杞ID:11，其序列如SEQIDNO:2所示；枸杞ID:12
‑
1，其序列如SEQIDNO:3所示；枸杞ID:12
‑
2，其序列如SEQIDNO:4所示；枸杞ID:2，其序列如SEQIDNO:5所示；枸杞ID:3，其序列如SEQIDNO本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于靶向测序的枸杞S基因快速分型鉴定，其特征在于，依据若干参考枸杞品种的S基因设计探针，利用设计的探针组合物对待测枸杞样品的基因进行杂交捕获、测序分析，并将测序结果与参考枸杞品种的S基因进行比对，判断待测枸杞样品的S基因与所述参考枸杞品种的S基因是否匹配，确定待测枸杞样品S基因所匹配的参考枸杞品种。2.根据权利要求1所述的一种基于靶向测序的枸杞S基因快速分型鉴定，其特征在于，所述参考枸杞品种的S基因采用已知枸杞品种的S基因；若干所述参考枸杞品种的S基因如SEQIDNO:1～15所示。3.根据权利要求2所述的一种基于靶向测序的枸杞S基因快速分型鉴定，其特征在于，依据所述参考枸杞品种的S基因设计的探针组合物，包括50条探针序列，所述50条探针序列如SEQIDNO:16～65所示。4.根据权利要求1所述的一种基于靶向测序的枸杞S基因快速分型鉴定，其特征在于，利用设计的探针组合物对待测枸杞样品的基因进行杂交捕获、测序分析，包括如下步骤：步骤1、样品文库的制备：枸杞基因组...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦垦，高燕，戴国礼，李彦龙，焦恩宁，黄婷，张波，何盺孺，周旋，段淋渊，石志刚，安巍，曹有龙，张曦燕，王翠平，赵启凤，
申请(专利权)人：宁夏农林科学院枸杞科学研究所，
类型：发明
国别省市：