一种改进的基于动态显色法的工业内毒素检测鲎试剂盒及其使用方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种改进的基于动态显色法的工业内毒素检测鲎试剂盒及其使用方法和应用。所述改进的基于动态显色法的工业内毒素检测鲎试剂盒包括反应主剂；所述反应主剂包括C因子、B因子、凝固酶原、多肽显色基质、昆布聚糖、冻干赋形剂和稳渗剂。本发明专利技术中所述试剂盒的反应原理为通过凝固酶酶切多肽显色基质，产生游离的2,4

【技术实现步骤摘要】
一种改进的基于动态显色法的工业内毒素检测鲎试剂盒及其使用方法和应用


[0001]本专利技术属于检测试剂盒类制造
，具体涉及一种改进的基于动态显色法的工业内毒素检测鲎试剂盒及其使用方法和应用。

技术介绍

[0002]内毒素是革兰氏阴性菌菌体中毒性物质的总称，是多种革兰氏阴性菌的细胞壁成分，由菌体裂解后释放，又称之为“热原”，内毒素的主要化学成分为脂多糖。脂多糖分子由菌体特异性多糖、非特异性核心多糖和类脂A三部分构成，毒性成分主要为类脂A。各种细菌内毒素的毒性作用大致相同，主要表现为引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等。
[0003]由于内毒素是细菌死亡裂解或自溶产生的，因此环境中存在大量内毒素，当其通过机体消化道进入人体时并无危害，少量通过注射进入血液后被肝脏枯否细胞（Kupffer cells，KC）灭活，也不会造成对机体的损害。当内毒素大量进入并聚集于血液中，其含量超过机体各自卫系统的清除能力，则可导致不同程度的内毒素血症。因此，对于易于引入内毒素的注射药品、生物制品和医疗器械等必须通过内毒素检测。
[0004]鲎血液包含两类细胞，其中一类为颗粒细胞（granular hemocyte或granulocyte），或称之为变形细胞（amebactye），成年鲎只含有这类细胞。鲎血液凝集和哺乳动物的血液凝集相似，是一系列级联酶反应。鲎试剂为鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，鲎试剂中含有C因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原。在适宜的条件下，细菌内毒素激活C因子，引起一系列酶促反应，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。
[0005]根据《中国药典》2020版通则1143内毒素检查法有关规定，细菌内毒素检查法包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
[0006]凝胶法系通过鲎试剂和内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法，但所述方法不能进行定量，且由于待测样品中干扰物质的影响易产生假阳性或假阴性。
[0007]浊度法系利用鲎试剂和内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法，根据检测原理可分为终点浊度法和动态浊度法，但所述方法反应主剂易受到待测样品中蛋白及药物的干扰产生非特异性浊度。
[0008]显色基质法系利用检测鲎试剂和内毒素反应过程中产生的凝固酶使显色底物释放出对硝基苯甲酸的多少对内毒素含量进行测定的方法，根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法；动态显色法是检测反应混合物的吸光度或透光率达到某一预先设定的检测值所需要的反应时间，或检测值增加速度的方法，所述方法不依赖凝固蛋白聚合成凝胶，灵敏度高、抗干扰能力强。
[0009]因此，提供一种灵敏度高、抗干扰能力强，适用于注射药物、生物制品及医疗器械等样本中的细菌内毒素定量检测试剂盒，在内毒素检测领域具有重要应用前景。

技术实现思路

[0010]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种改进的基于动态显色法的工业内毒素检测鲎试剂盒及其使用方法和应用。本专利技术所述提供的试剂盒包括反应主剂、主剂复溶液、无热原水、标准品和质控品；所述反应主剂中添加了昆布聚糖能够提高抗干扰能力、增加检测的灵敏度；所述多肽显色基质为Boc
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Leu
‑
Gly
‑
Arg末端连接2,4
‑
二硝基苯胺的合成三肽或四肽，通过采用凝固酶酶切所述多肽显色基质，产生游离的2,4
‑
二硝基苯胺，用酶标仪直接进行检测，使用本专利技术所述试剂盒进行检测能缩短检测路线、降低成本，应用动态显色法能实现对人用和动物用注射药物、生物制品及医疗器械等样本中的细菌内毒素准确定量检测，相对于传统的PNA显色基质法，2,4
‑
二硝基苯胺的结构上多一个硝基，颜色更深、灵敏度更高，并且加入昆布聚糖后反应主剂不易受到待测样品中蛋白及药物的干扰产生非特异性浊度。
[0011]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种改进的基于动态显色法的工业内毒素检测鲎试剂盒，所述工业内毒素检测指在医疗器械、细胞培养、生物医药、疫苗、注射剂等非临床领域的内毒素检测，所述改进的基于动态显色法的工业内毒素检测鲎试剂盒包括反应主剂；所述反应主剂包括C因子、B因子、凝固酶原、多肽显色基质、昆布聚糖、冻干赋形剂和稳渗剂。
[0012]在本专利技术中，所述反应主剂中添加入了G因子抑制剂昆布聚糖，所述昆布聚糖可以屏蔽(1,3)β
‑
D葡聚糖对反应的支路干扰。鲎血细胞中含有C因子、G因子、B因子、凝固酶原和凝固蛋白原等，C因子被待测样品中的内毒素激活，形成活化C因子，活化C因子激活B因子，形成活化B因子，活化B因子使凝固酶原转化为凝固酶，凝固酶酶切多肽显色基质产生游离的2,4
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二硝基苯胺，2,4
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二硝基苯胺在405 nm波长具有明显吸收峰；而G因子也可以被(1,3)β
‑
D葡聚糖激活为活化G因子，活化G因子也可以使凝固酶原转化为凝固酶，继而通过凝固酶酶切多肽显色基质产生游离的2,4
‑
二硝基苯胺而显色，因此旁路反应对内毒素激活的C因子反应支路存在干扰作用。加入G因子抑制剂，即(1,3)β
‑
D葡聚糖结构类似物昆布聚糖，可以提前占据G因子活化位点，使后续反应无法进行，从而达到抑制支路反应的作用。
[0013]优选地，所述多肽显色基质包括Boc
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Leu
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Gly
‑
Arg
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C6H5N3O4（2,4
‑
二硝基苯胺）和/或Boc
‑
Ile
‑
Gly
‑
Arg
‑
C6H5N3O4（2,4
‑
二硝基苯胺）。
[0014]在本专利技术中，所述多肽显色基质上的显色基团为2,4
‑
二硝基苯胺（2,4
‑
Dinitroaniline），和对硝基苯胺（PNA）相比本专利技术所述的多肽显色基质的显色程度更深、灵敏度更高，本专利技术中所使用的2,4
‑
二硝基苯胺多肽化合物结构如图1所示。
[0015]优选地，所述冻干赋形剂包括质量比为(1.0
‑
3.0):(0.2
‑
0.8):(1.0
‑
5.0)的聚乙烯吡咯烷酮、棉子糖和甘露醇，例如可以是1.0:0.2:1.0、2.0:0.5:3.0或3.0:0.8:5.0等。
[0016]优选地，所述稳渗剂包括质量比为(1.5
‑
3.0):(3.0
‑
5.0):(1.0
‑
1.5)的蔗糖、甘油和氯化钠，例如可以是1.5:3.0:1.0、2.0:4.0:1.2或3.0:5.0:1.5等。
[0017]在本专利技术中，所述反应主剂中添加了冻干赋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种改进的基于动态显色法的工业内毒素检测鲎试剂盒，其特征在于，所述改进的基于动态显色法的工业内毒素检测鲎试剂盒包括反应主剂；所述反应主剂包括C因子、B因子、凝固酶原、多肽显色基质、昆布聚糖、冻干赋形剂和稳渗剂。2.根据权利要求1所述的改进的基于动态显色法的工业内毒素检测鲎试剂盒，其特征在于，所述多肽显色基质包括Boc
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Leu
‑
Gly
‑
Arg
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C6H5N3O4和/或Boc
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Ile
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Gly
‑
Arg
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C6H5N3O4；所述冻干赋形剂包括质量比为(1.0
‑
3.0):(0.2
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0.8):(1.0
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5.0)的聚乙烯吡咯烷酮、棉子糖和甘露醇；所述稳渗剂包括质量比为(1.5
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3.0):(3.0
‑
5.0):(1.0
‑
1.5)的蔗糖、甘油和氯化钠。3.根据权利要求1所述的改进的基于动态显色法的工业内毒素检测鲎试剂盒，其特征在于，所述反应主剂由以下制备方法制备得到：（1）采血和分离细胞：将从活体鲎心门采集的血液置于含有抗凝剂的采血瓶中，离心，弃去上清液，收集鲎血细胞；（2）裂解：将步骤（1）得到的鲎血细胞和RIPA裂解液混合，冷冻后再进行解冻，得到鲎血细胞溶解物；（3）提取分离：先将步骤（2）得到的鲎血细胞溶解物和饱和硫酸铵溶液混合，进行一次离心收集上清一，弃去沉淀一，再将上清一和饱和硫酸铵溶液混合，进行二次离心收集沉淀二，弃去上清液二；将沉淀二复溶并透析除去溶液中的硫酸铵，即得含有C因子、B因子和凝固酶原的提取液；（4）制剂：将步骤（3）得到的提取液、多肽显色基质、昆布聚糖、冻干赋形剂和稳渗剂混合，进行搅拌，冷冻干燥，得到反应主剂。4.根据权利要求3所述的改进的基于动态显色法的工业内毒素检测鲎试剂盒，其特征在于，步骤（1）的具体步骤为：将从活体鲎心门采集的血液置于含有抗凝剂的采血瓶中，所述抗凝剂和血液的体积比为1:(5
‑
9)；以600
‑
1500 rpm的转速离心15
‑
25 min，弃去上清液，收集鲎血细胞。5.根据权利要求3所述的改进的基于动态显色法的工业内毒素检测鲎试剂盒，其特征在于，步骤（2）的具体步骤为：将步骤（1）得到的鲎血细胞和RIPA裂解液混合，所述鲎血细胞和RIPA裂解液的体积比为10:(5
‑
9)；再于
‑
25~
‑
20℃下冷冻12 h以上，然后解冻，得到鲎血细胞溶解物；其中，所述RIPA裂解液包括：20
‑
30 mM Tris
‑
HCl、100
‑
200 mM NaCl、0.5
‑
1 wt% NP
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40、0.5
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1 wt%去氧胆酸钠和0.1
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0.15 wt%十二烷基硫酸钠，溶剂为无热源水，所述裂解液的pH值为7.2
‑
8.0。6.根据权利要求3所述的改进的基于动态显色法的工业内毒素检测鲎试剂盒，其特征在于，步骤（3）的具体步骤为：先将步骤（2）得到的鲎血细胞溶解物和pH为7.0
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8.0的饱和硫酸铵溶液混合，得到混合液一，所述混合液一中硫酸铵终浓度为20
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30%，3
‑
5℃、10000
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11000 g离心8
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12 min收集上清一，弃去沉淀一，再将上清一和pH为7.0
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘浩宇，盛长忠，粟艳，周泽奇，
申请(专利权)人：丹娜天津生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：