【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的引物及其应用。
技术介绍
1、呼吸道合胞病毒（rsv）是一种具有丝状包膜的单股负链rna病毒，包括a和b两种抗原亚型。rsv两个亚型一般交替流行或共同流行，两亚型在临床表现、感染年龄等方面并无明显差异，且治疗方式一致。在婴幼儿中，该病毒通常引发下呼吸道感染，包括细支气管炎和肺炎。因此，准确的早期诊断是及时开展治疗、减少经济负担、降低死亡率的有效措施。
2、目前常用的检测方法有基于检测病原体特异性基因的核酸检测技术、基于检测病原体抗原或抗体的免疫检测技术等。传统的诊断方法，如病毒培养和直接/间接免疫荧光法，费时、费力，灵敏度有限；抗体检测无法在病毒感染早期获得可靠数据；高灵敏度核酸扩增检测是现在应用最广泛的呼吸道病毒感染检测手段，然而其需要专业的检测环境与检测人员，使之无法推广至基层医疗机构。
3、聚合酶链反应（polymerase chain reaction, pcr）是目前非常流行的分子检测方法，开发周期短，灵敏性及特异性高，然而该方法需要昂贵的仪器，且需要训练有素的专业人员操作整个程序。恒温扩增技术的兴起无疑是病原体核酸检测领域的一大突破。恒温扩增技术的优点是不需特殊的仪器设备，可以在特定的温度对体系中的核酸进行扩增与鉴定。然而，每种恒温扩增方法也存在不同的问题，其中应用最为广泛的环介导恒温扩增法（lamp），这种方法需要针对6个区域设计4条引物，十分复杂，且反应温度较高；重组酶聚合酶扩增（rpa）虽然基本满足了所有需求，但其假阳性的概率相
4、cn111778357a公开了一种基于crispr/cas12a的呼吸道合胞病毒核酸快速检测试剂盒及其检测方法，所述方法靶向rsv f基因进行核酸检测，采用rt-raa结合crispr/cas12a检测体系，分别检测a型及b型rsv。分开检测两个亚型虽然对流行病学分析有一定的指导作用，但增加了检测成本，没有很大的临床应用价值。
5、cn114717362a及cn114807435a两项专利均利用crispr/cas13a为检测体系，cas13a识别单链rna，检测时还需将扩增得到的dna转录为rna，体系比cas12a更复杂；同时两项专利虽未区分两个亚型，但也未明确指出可同时检测两个亚型，通过比对专利中的引物序列，主要检出类型为a型rsv，无法确定是否能够检测b型rsv，检测灵敏性低。
6、综上所述，目前检测呼吸道合胞病毒核酸的方法存在无法准确同时检出a型和b型rsv，灵敏度，特异性差等问题。如何提供一种用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的引物及方法，在恒温下完成核酸扩增及检测，提高灵敏性和准确性，已成为目前生物
亟待解决的问题之一。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的引物及其应用，解决了目前呼吸道合胞病毒核酸检测方法无法同时检测a型及b型rsv，假阳性概率高，成本高，操作复杂，灵敏性低等问题，可在恒温下完成核酸扩增及检测，通过两轮特异性信号扩大提高了检测的准确性和灵敏性。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的引物，所述引物的核酸序列包括seq id no.1和seq id no.2或seq id no.1和seq id no.3所示的序列中的任意一组。
4、比对ncbi现有a型及b型rsv基因序列，n基因序列相对保守，可通过在系统中加入两条sgrna，在一个反应体系中同时识别a型及b型rsv。本专利技术创造性地设计了用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的引物及sgrna，采用rt-era结合crispr/cas12a检测体系，靶向rsvn基因，可同时检测a型及b型rsv，可在恒温下完成核酸扩增及检测，检测灵敏度更高，特异性更强，不需要专业的仪器设备及操作人员，便于推广。
5、本专利技术中包括两大体系：第一个是重组酶聚合酶恒温扩增体系，实现了对核酸的第一轮特异性信号放大；第二个是crispr/cas12a检测系统，利用cas12a的靶向切割活性，进一步提高检测的特异性，利用其随之激活的附带切割活性，将放到这个系统中的探针（ssdna reporter）切割开，实现第二轮信号放大，提高整体检测的灵敏度并使之适用于荧光检测。当出现明显的荧光信号，说明体系中存在待检测病毒。技术原理图如图1所示。
6、seq id no.1（rsv-n-f）：
7、atggctcttagcaaagtcaagttgaatgatac。
8、seq id no.2（rsv-n-r1）：
9、atttatgattagcatcttctgtgattaataacat。
10、seq id no.3（rsv-n-r2）：
11、cttcctaatctagacatagcatataacatacct。
12、第二方面，本专利技术提供了第一方面所述的用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的引物在制备用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的产品中的应用。
13、第三方面，本专利技术提供了试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的引物。
14、第四方面，本专利技术提供了第一方面所述的用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的引物在检测呼吸道合胞病毒核酸中的应用。
15、第五方面，本专利技术提供了一种检测呼吸道合胞病毒核酸的方法，所述方法包括：
16、利用第一方面所述的用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的引物对待测样本的dna进行重组酶聚合酶恒温扩增，配制crispr/cas12a检测体系，然后进行实时荧光定量pcr检测。
17、优选地，所述crispr/cas12a检测体系包括：第一方面所述的用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的引物。
18、优选地，所述crispr/cas12a检测体系还包括：rt-era扩增反应试剂、rt-era反应buffer、醋酸镁、cas12a酶、ssdna reporter、特异性sgrna、cas12a检测buffer和无核酸酶水。
19、优选地，所述扩增引物组的浓度为0.1-1 μm。
20、上述0.1-1 μm中的具体点值可以选择0.1 μm、0.2 μm、0.3 μm、0.4 μm、0.5 μm、0.6 μm、0.7 μm、0.8 μm、0.9 μm、1 μm等。
21、优选地，所述cas12a酶的浓度为10-200 nm。
22、上述10-200 nm中的具体点值可以选择10 μm、20 μm、30 μm、40 μm、50 μm、60 μm、100 μm本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一种用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的引物，其特征在于，所述引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示的序列中的任意一组。
2.权利要求1所述的用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的引物在制备用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的产品中的应用。
3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的引物。
4.权利要求1所述的用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的引物在检测呼吸道合胞病毒核酸中的应用。
5.一种检测呼吸道合胞病毒核酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a检测体系包括：权利要求1所述的用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的引物；
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述特异性sgRNA的制备方法包括：针对呼吸道合胞病毒的N基因设计sgRNA，设计完成后合成与之对应的DNA oligo，利用含有T7启动子序列的上游引物及含有靶序列的
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述特异性sgRNA包括sgRNA1和sgRNA2；
9. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物的扩增靶点包括A型RSV N基因和/或B型RSV N基因。
10.根据权利要求5的方法，其特征在于，所述待测样本包括血浆、咽拭子、唾液或组织中的任意一种。
...【技术特征摘要】
1. 一种用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的引物，其特征在于，所述引物的核酸序列包括seq id no.1和seq id no.2或seq id no.1和seq id no.3所示的序列中的任意一组。
2.权利要求1所述的用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的引物在制备用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的产品中的应用。
3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的引物。
4.权利要求1所述的用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的引物在检测呼吸道合胞病毒核酸中的应用。
5.一种检测呼吸道合胞病毒核酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述crispr/cas12a检测体系包括：权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚雪春，王志贤，盛长忠，周泽奇，粟艳，
申请(专利权)人：丹娜天津生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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