一种NLRP3启动子甲基化的检测引物组合物、应用及检测方法技术

本发明专利技术公布了一种NLRP3启动子甲基化的检测引物组合物、应用及检测方法，通过设计包括上游引物cg21919599

【技术实现步骤摘要】
一种NLRP3启动子甲基化的检测引物组合物、应用及检测方法


[0001]本专利技术属于分子生物检测
，具体涉及一种NLRP3启动子甲基化的检测引物组合物、应用及检测方法。

技术介绍

[0002]肾癌是威胁人们健康的常见恶性肿瘤之一。我国肾癌的发病率近年来一直处于显著的上升趋势，其发病率年增长率高达5％，成为我国肿瘤发病率和死亡率增长最快的肿瘤之一。早期肾癌局限于肾脏包膜内，5年生存期高达90％以上；但当肿瘤扩散到包膜外或远处转移时，肿瘤的治疗就相当困难且预后较差，5年生存期仅有15％左右。更为重要的是，由于早期肾癌往往无临床症状，且临床上缺乏肾癌早期诊断分子标志物，有近30％的患者初诊即为晚期。因此，临床上亟需寻找到简便易行的分子标志物，以实现肾癌的早期诊断，从而提高肾癌患者的总体生存期。
[0003]肾癌早期并无明显的症状，因其位置较隐蔽，较难发现。肾癌的诊断，除了依据“肾癌三联征”的临床症状外，主要依据影像学检查，包括腹部超声(US)、核磁共振成像(MRI)及X射线计算机断层扫描(CT)。超声检查目前多用彩色超声，可以鉴别肾实质性肿瘤和肾囊性肿块，但是即使超声造影也很难与其它肾脏实质性病变区别；CT是目前肾癌诊断最常用和最重要的手段，理论上可以清晰的显示肾实质瘤的部位、范围、形态，可发现早期癌变的肾脏，增强后肿瘤一般均会强化，且透明细胞癌则类似于肝癌呈现“快进快出”强化方式；MRI可以从各个角度清晰的显示肿瘤的形态，侵犯的范围及粘连程度，主要是对肾癌的分期较明确，另外有助于诊断是否合并癌栓。
>[0004]NLRP3炎性小体作为固有免疫的重要组分在机体免疫反应和疾病发生过程中具有重要作用。由于能被多种类型的病原体或危险信号所激活，NLRP3炎症小体在多种疾病过程中都发挥了关键作用，包括最初被确认的家族性周期性自身炎症反应，到II型糖尿病、阿尔兹海默症和动脉粥样硬化症等。因此，作为炎症反应的核心，NLRP3炎症小体可能为各种炎症性疾病的治疗提供新的靶点。
[0005]NLRP3受体蛋白含有PYD、NACHT、LRR三个结构域，炎症小体组装情况下，其PYD结构域和ASC的PYD结构域结合形成同型PYD:PYD相互作用(PPI)，而ASC中的CARD结构域又可以和效应蛋白的CARD结构域结合形成类似的CARD:CARD相互作用，这样ASC在这里起到桥梁作用，连接受体蛋白和效应蛋白。在受体蛋白受到激动剂刺激时，通过以上相互作用最后激活caspase
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1，诱导其自切割并活化。活化的caspase
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1可以切割并促使细胞白介素和其他细胞因子的成熟。而细胞白介素的释放对于细胞的炎症反应起到重要作用。除此之外，caspase
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1的成熟对于细胞的死亡也起到不可磨灭的作用。NLPR3的激动剂十分广泛，大体有这几种：钙离子的胞质压力、活性氧(ROS)压力、氢质子的胞质压力、钾离子外流、细菌mRNA、氧化线粒体DNA压力、溶酶体不稳定等。也正因为如此，激动剂
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受体蛋白具体的作用机制和信号轴一直尚不完全清楚。而最近的研究提示，高尔基体反面网状结构的解体可能对信号传递起到至关重要的作用。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术中的问题，本专利技术提供一种NLRP3启动子甲基化的检测引物组合物、应用及检测方法，通过设计检测引物组合物，利用焦磷酸测序技术检测NLRP3启动子cg21919599甲基化的水平，该方法灵敏度及准确性高，对于肾癌的病理分期及早期检测、预后和风险评估具有重要的意义。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：
[0008]本专利技术第一方面提供一种NLRP3启动子甲基化的检测引物组合物，所述引物组合物包括上游引物cg21919599
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F、下游引物cg21919599
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Rbio和测序引物cg21919599
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S，所述cg21919599
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述cg21919599
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Rbio的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述cg21919599
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S的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0009]在一个优选的实施方案中，所述NLRP3启动子甲基化位点为cg21919599，所述cg21919599位于基因启动子转录起始位点上游2789bp处。
[0010]本专利技术第二方面提供一种NLRP3启动子甲基化的检测引物组合物在制备NLRP3启动子甲基化检测工具中的应用。
[0011]在一个优选的实施方案中，所述检测工具包括但不限于作为单独检测试剂、检测试剂盒。
[0012]本专利技术还提供一种NLRP3启动子甲基化的检测引物组合物在制备肾癌检测检测工具中的应用。
[0013]在一个优选的实施方案中，上述应用中NLRP3启动子甲基化位点为cg21919599，所述cg21919599位于基因启动子转录起始位点上游2789bp处。
[0014]本专利技术第三方面提供NLRP3启动子甲基化的检测工具，所述工具包括上述的引物组合物。
[0015]本专利技术第四方面提供一种利用上述的引物组合物检测NLRP3启动子甲基化的方法，包括以下步骤；
[0016]S1、待测样本DNA的提取；
[0017]S2、对步骤S1提取的样本DNA进行转化和纯化处理；
[0018]S3、利用上游引物上游引物cg21919599
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F和下游引物cg21919599
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Rbio对步骤S2得到的DNA进行PCR扩增；
[0019]S4、利用测序引物cg21919599
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S对步骤S3得到的扩增后的PCR产物进行焦磷酸测序。
[0020]在一个优选的实施方案中，步骤S2中样本DNA的浓度大于50ng/μL，样本的总量大于500ng。
[0021]在一个优选的实施方案中，步骤S3中扩增的反应体系如下：
[0022][0023]加水至25μL，反应程序为98℃10s，55℃30s，72℃30s，40个循环；72℃，1min；4℃，保持。
[0024]本专利技术中NLRP3(NLR family pyrin domain containing 3)基因在genebank中的登录号为NC_000001.11，位于1号染色体上，基因组序列全长为32661bp(247416163
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247448823)。
[0025]本专利技术的有益效果如下：
[0026](1)本专利技术发现NLRP3启动子甲基化位点可以作为一种新的肾癌DNA标志物，通过设计NLRP3启动子甲基化的检测引物，利用检测引物对肾癌进行检测，在肾癌早期检测和诊断、预后中有重要的价值。
[0027](2)本专利技术中NLRP3启动子甲基化水平可作为肾癌分级分期的的标准本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种NLRP3启动子甲基化的检测引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括上游引物cg21919599
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F、下游引物cg21919599
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Rbio和测序引物cg21919599
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S，所述cg21919599
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述cg21919599
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Rbio的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述cg21919599
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S的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.根据权利要求1所述的一种NLRP3启动子甲基化的检测引物组合物，其特征在于，所述NLRP3启动子甲基化位点为cg21919599，所述cg21919599位于基因启动子转录起始位点上游2789bp处。3.权利要求1所述的NLRP3启动子甲基化的检测引物组合物在制备NLRP3启动子甲基化检测工具中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测工具包括但不限于作为单独检测试剂、检测试剂盒。5.权利要求1所述的NLRP3启动子甲基化的检测引物组合物在制备肾癌检测工具中的应用。6.根据权利要求3
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【专利技术属性】
技术研发人员：邓务国，龙谦，李振江，
申请(专利权)人：湖南灵康医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：