房水cfDNA的提取方法、试剂盒以及在PVRL临床辅助检查中的应用技术

本发明专利技术涉及使用房水cfDNA进行基因检测来辅助临床诊断，属于基因检测技术领域。本发明专利技术发现利用房水中的cfDNA进行检测，并比对于参考基因组上，获得的突变信息能够有效地对原发性玻璃体视网膜淋巴瘤(PVRL)进行诊断，检测结果显著优于从血浆中对cfDNA的检测准确性，能够实现早期诊断。够实现早期诊断。够实现早期诊断。

【技术实现步骤摘要】
房水cfDNA的提取方法、试剂盒以及在PVRL临床辅助检查中的应用


[0001]本专利技术涉及使用房水cfDNA进行基因检测来辅助临床诊断，属于基因检测


技术介绍

[0002]近年来，全球癌症发病率和死亡率不断上升，癌症已经成为全球范围内主要的公共健康问题。2020年，全球预计有近1930万新增癌症病例(男性1007万，女性923万)，以及约1000万因癌症而死亡的病例。乳腺癌已取代肺癌成为最常见的癌症，占全球每年新发病例的近12％。而癌症作为复杂和多样性的疾病，在分子遗传上具有很大的异质性，因此，对于癌症病人的个体化、精准化的诊疗至关重要。基因检测在癌症早期筛查，辅助癌症诊断/鉴别诊断，指导靶向治疗、免疫治疗，疗效评估、MRD监测等方面具有重要的意义。二代测序技术(NGS)能够实现高通量，同时对上百万甚至数十亿个DNA分子进行测序。在肿瘤临床应用中，NGS已经成为精准诊疗的重要环节。
[0003]游离DNA(cellfreeDNA，cfDNA)是机体细胞凋亡、坏死后释放或分泌到体液中的片段化DNA。癌症患者的cfDNA总体水平高于健康人。在癌症患者中，从肿瘤细胞释放的cfDNA通常被称为循环肿瘤DNA(cfDNA)，能够反映肿瘤细胞的基因组特征，包括基因突变、基因重排、拷贝数变异等。利用cfDNA进行液体活检，相比于组织活检，具有克服肿瘤组织的异质性、样本可及性高、样本类型多、微创等优点，故液体活检正迅速成为标准肿瘤活检的重要辅助手段。近年来，cfDNA液态活检在肿瘤的预后和生物标志物预测方面已经显示了巨大的前景。血液、尿液、脑脊液(CSF)、胸水和腹水等都可以用来作为液体活检样本。
[0004]原发性玻璃体视网膜淋巴瘤(PVRL)是指原发于眼内累及玻璃体、视网膜、或视神经等的原发性中枢神经系统淋巴瘤(PCNSL)。大约95％的PVRL都属于弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。PVRL临床表现多样，常表现为反复发作的葡萄膜炎，早期难以识别，诊断困难，从出现眼部症状至确诊通常需要1年的时间。因PVRL和葡萄膜炎的两者临床症状类似，仅通过眼部症状无法区分，需借助眼内液的细胞病理学检查。临床上眼内液的细胞病理学主要是指玻璃体的病理学检测，是确诊的金标准。由于PVRL难以诊断和玻璃体液可能存在取样困难，因此迫切需要寻找适合PVRL患者的新的液体活检样本。
[0005]房水(Aqueoushumour)，又称水状液、神水，是充满眼球前房和后房，夹在角膜和晶状体之间的透明液体，由睫状体的无色素上皮细胞分泌，其总体积大约0.25mL，平均分泌的速度约每分钟2.5μL(0.0025mL)。房水的成分与血浆类似，但其中抗坏血酸、丙酮酸、乳酸等的浓度更高，而蛋白、糖和一些代谢废物的浓度更低。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是：原发性玻璃体视网膜淋巴瘤(PVRL)的诊断过程中，存在着临床症状类似，诊断难度大；通过玻璃体取样存在着取样困难的问题。本专利技术提
供了一种使用房水cfDNA进行基因检测来辅助临床诊断的方法。
[0007]本专利技术的第一个目的是提供了：
[0008]一种房水cfDNA的提取方法，包括如下步骤：
[0009]步骤1，对房水样本进行离心预处理，得到上清液；
[0010]步骤2，步骤1中的上清液经过第一次裂解、消化、第二次裂解处理；
[0011]步骤3，将步骤2中得到的裂解液进行DNA的析出处理；
[0012]步骤4，对步骤3中得到的DNA析出液采用柱吸附、洗脱处理后，得到cfDNA。
[0013]在一个实施方式中，步骤2中，第一次裂解和/或第二次裂解的步骤中，裂解液与样品溶液的体积比是1
‑
3：1。
[0014]在一个实施方式中，步骤2中，消化处理中加入Carrier RNA和蛋白酶K。
[0015]在一个实施方式中，Carrier RNA的加入量是10
‑
50μl/mL。
[0016]在一个实施方式中，蛋白酶K的加入量是200μl/mL。
[0017]在一个实施方式中，步骤3中，加入DNA析出液的量是样本体积的0.5
‑
2倍。
[0018]在一个实施方式中，步骤4中，洗脱处理是指依次采用盐洗涤溶液、醇洗涤溶液和无水乙醇洗涤。
[0019]本专利技术的第二个目的是提供了：
[0020]一种房水cfDNA提取试剂盒，包括：裂解液、消化试剂、DNA析出液、洗脱液。
[0021]在一个实施方式中，所述的裂解液包括第一裂解液和第二裂解液。
[0022]在一个实施方式中，所述的消化试剂包括Carrier RNA和蛋白酶K。
[0023]在一个实施方式中，第一裂解液、第二裂解液、Carrier RNA和蛋白酶K的体积比是1：0.5
‑
1.5：0.01
‑
0.03：0.1
‑
0.3。
[0024]本专利技术的第三个目的是提供了：
[0025]用于对房水cfDNA中突变检测的试剂在用于制备原发性玻璃体视网膜淋巴瘤(PVRL)诊断试剂中的应用；所述的突变检测的试剂中还包括上述的房水cfDNA提取试剂盒。
[0026]在一个实施方式中，所述的突变检测试剂是用于检测cfDNA中的单核苷酸变异(SNV)和插入缺失变异(Indel)。
[0027]有益效果
[0028]本专利技术发现利用房水中的cfDNA进行检测，并比对于参考基因组上，获得的突变信息能够有效地对原发性玻璃体视网膜淋巴瘤(PVRL)进行诊断，检测结果显著优于从血浆中对cfDNA的检测准确性，能够实现早期诊断。
附图说明
[0029]图1是P1患者CD79B突变位点测序结果图
[0030]图2是P3患者BTG2突变位点测序结果图
具体实施方式
[0031]本专利技术中的突变，是指指单核苷酸变异(SNV)和插入缺失变异(Indel)，具体而言：
[0032]单核苷酸变异(SNV)：单个碱基置换引起，导致编码氨基酸发生变化，如EGFR基因L858R。
[0033]插入缺失突变(Indel)：多个碱基插入或缺失导致编码氨基酸的增加/减少，这些类型的突变可能是“框内的”，导致蛋白质中氨基酸的加入或减少，如EGFR基因第19号外显子缺失；或可导致“移码”，通常导致蛋白质的过早截短。
[0034]本专利技术中突变的检测过程中，通过对测序下机数据比对于参考基因组/参考序列上，获得存在突变的位点，这里的参考基因组/参考序列指任何生物体或病毒的任何具体的已知基因组序列(无论是部分的或完整的)，它可以用于对来自受试者的识别的序列进行参比。例如，用于人类受试者以及许多其他生物体的参考基因组可见于美国国家生物技术信息中心(ncbi.nlm.nih.gov)，对于人的样品来说，参照序列可以是人基因组hg18或hg19的序列。目前hg19的相关数据库相本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种房水cfDNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，对房水样本进行离心预处理，得到上清液；步骤2，步骤1中的上清液经过第一次裂解、消化、第二次裂解处理；步骤3，将步骤2中得到的溶液进行DNA的析出处理；步骤4，对步骤3中得到的DNA析出液采用柱吸附、洗脱处理后，得到cfDNA。2.根据权利要求3所述的房水cfDNA的提取方法，其特征在于，步骤2中，第一次裂解和/或第二次裂解的步骤中，裂解液与上清液的体积比是1
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3：1；在一个实施方式中，步骤2中，消化处理中加入Carrier RNA和蛋白酶K；在一个实施方式中，Carrier RNA的加入量是10
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50μl/mL；在一个实施方式中，蛋白酶K的加入量是200μl/mL。3.根据权利要求3所述的房水cfDNA的提取方法，其特征在于，在一个实施方式中，步骤3中，析出处理中所加入DNA析出液的量是溶液体积的0.5
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2倍。4.根据权利要求3所述的房水cfDNA的提取方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘璟文，闫重光，邵阳，史其萍，汪笑男，孙小慧，孙泽华，
申请(专利权)人：南京世和医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：