一种血浆游离DNA来源的甲基化检测方法、肺癌诊断标志物以及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种血浆游离DNA来源的甲基化检测方法、肺癌诊断标志物以及试剂盒，属于基因检测技术领域。使用一种优化的MBD

【技术实现步骤摘要】
一种血浆游离DNA来源的甲基化检测方法、肺癌诊断标志物以及试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种血浆游离DNA来源的甲基化检测方法、肺癌诊断标志物以及试剂盒，属于基因检测


技术介绍

[0002]肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤，也是我国死亡率最高的癌种。肺癌可以分为两大类：小细胞肺癌（Small cell lung cancer）和非小细胞肺癌（Non small cell lung cancer）。非小细胞肺癌（NSCLC）包含腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌。非小细胞肺癌约占所有肺癌的80%，腺癌约占非小细胞肺癌的55%。早期肺癌症状不明显，大约75%的患者发现时已处于中晚期，且5年生存率很低。由于肺癌的异质性，往往预后效果不佳。
[0003]目前，胸部低剂量CT是现阶段肺癌早期筛查的最常用的方法，能检测直径5mm以上的肿瘤。但该方法存在辐射暴露、过度诊断、灵敏度不够等问题。液体活检是近年来备受关注的一种体外诊断技术，通过非侵入性取样的方法，能检测肿瘤或转移到血液循环中的肿瘤细胞和肿瘤DNA片段。对于筛选检测早期肿瘤、评价药物疗效具有十分重要的意义。目前最常用的是ctDNA 的检测。ctDNA是肿瘤细胞破裂后释放到人体循环系统中的小片段DNA，可能携带肿瘤突变、插入、缺失、拷贝数变异等遗传信息。因此基于人血液来源的ctDNA检测对于癌症的早期诊断和癌症治疗过程中的疗效评估具有十分重要的意义。
[0004]DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分。在人体中，经常发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。大量研究表明，在肿瘤的发生和发展中存在DNA 甲基化水平和模式的混乱，包括整体基因组甲基化水平过低和局部基因启动子区域甲基化过高。已有研究发现，在肺癌中甲基化的异常不仅在组织中被发现，在血浆、血液等体液中也能够检测到，并且随着肺癌的发生，甲基化异常程度也会增加。
[0005]基于液体活检技术的ctDNA甲基化研究在近年来越来越热。有研究表明，ctDNA 甲基化可在肿瘤发生的早期被检测到，而且具有较好的稳定性，因此 ctDNA 甲基化成为肿瘤液体活检中一个极具价值的标志物。甲基化检测方法包括重亚硫酸氢盐转换，其代表方法包括WGBS (whole
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genome bisulfite sequencing)。状态进行判断，以及基于蛋白质亲和富集的MBD
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seq（Methylated DNA Binding Domain Sequencing）技术，又称蛋白质富集全基因组甲基化测序。MBD
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seq方法利用MBD蛋白家族可以特异性的结合甲基化DNA的特性，从而富集到基因组上CpG高密度的甲基化DNA片段，并结合高通量测序技术，对富集到的DNA片段进行测序，从而检测全基因组范围内的甲基化水平。目前常用MBD
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seq技术进行甲基化DNA富集，其方法均是基于需要较高的DNA投入，投入量越高，MBD富集效果越好，因此大部分商品化试剂盒制造商会将MBD实验的进入量规定在1000ng以上，但是肿瘤来源的cfDNA提取量非常低，不可能实现大规模甲基化DNA富集。

技术实现思路

[0006]为了解决以上MBD
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seq富集cfDNA的问题，以及传统WGBS方法检测成本较高等问题，本专利技术对MBD
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seq技术进行了优化，以用于针对肺癌血浆cfDNA来源的，且较低投入量的cfDNA样本的富集甲基化检测，开发了一种新的cfDNA基因检测技术，辅助基于液体活检的早期肺癌的检测。本专利技术同时找到了通过上述方法获得的具有肺癌检测较高的甲基化标志物。
[0007]一种肺癌血浆游离DNA来源的甲基化检测方法，包括如下步骤：步骤1，制备链霉亲和素磁珠悬浮液，在链霉亲和素磁珠悬浮液中加入MBD蛋白，室温旋转孵育后洗涤后重悬，得到磁珠
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蛋白混合物；步骤2，提取得到cfDNA，再加入至步骤1中得到的磁珠
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蛋白混合物中，孵育后并洗涤；步骤3，对步骤2中的分离得到的磁珠进行洗脱，采用的洗脱液是NaCl溶液，洗脱过程步骤是先进行第一浓度洗脱，再进行第二浓度洗脱，收集全部洗脱液；所述的第一浓度是400
‑
600mM，第二浓度是800
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1200mM；步骤4，洗脱液中加入醋酸钠溶液、无水乙醇和糖原，使析出沉淀，经过分离、洗涤、干燥、复溶后，得到富集的DNA；步骤5，对步骤4中得到的富集的DNA进行测序，并进行甲基化分析。
[0008]所述的步骤1中，磁珠
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蛋白混合物以100μL计，其中含有5
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15μL MBD蛋白和5
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15μL链霉亲和素磁珠。
[0009]所述的步骤2中，cfDNA与磁珠
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蛋白混合物的配比是：10
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20ng:4
‑
10μL。
[0010]所述的步骤3中，第一浓度洗脱次数1
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3次，第二浓度洗脱次数2
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4次。
[0011]所述的步骤4中，醋酸钠溶液与洗脱液的体积比、无水乙醇与洗脱液的体积比分别为1：8
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12、1：1
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3；所述的醋酸钠溶液浓度2
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4M；沉淀过程于
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70℃以下至少2h。
[0012]检测血浆游离DNA来源的甲基化标志物的试剂在用于制备非小细胞肺癌诊断试剂中的应用；所述的甲基化标志物是由基因组上的20个甲基化区域所组成，所述的甲基化区域在基因组上的位置如下所示：
。
[0013]一种试剂盒，其中包含有用于对以上甲基化区域进行检测的试剂。
[0014]一种用于肺癌血浆游离DNA来源的甲基化检测装置，包括：提取模块：获取肺癌和健康人血浆样本，进行cfDNA提取；MBD富集甲基化DNA模块：用于通过MBD蛋白对cfDNA进行富集，其中通过具有优化的离子浓度的洗脱液进行洗脱，进行富集高甲基化DNA；甲基化文库构建模块：将富集到的高甲基化DNA通过接头连接构建预文库，然后通过酶转化、PCR扩增构建甲基化文库；测序模块：用于对甲基化文库进行全基因组甲基化高通量测序；质控模块：用于将测序数据接头、低质量序列去除，获得高质量数据；比对模块：用于将测序数据比对到参考基因组，并获得CpG位点上的支持甲基化的reads数和未甲基化的reads数；甲基化率数值计算模块：用于计算每个甲基化区域上的甲基化率；富集峰鉴定模块：用于比较阴性对照和富集样本鉴定出富集到的高甲基化区域；差异分析模块：用于基于富集峰鉴定出差异甲基化区域；
肺癌标志物筛选模块：利用机器学习，创建健康人和肺癌患者分类器，筛选出肺癌特异的甲基化标志物，并构建肺癌诊断回归模型。
[0015本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肺癌血浆游离DNA来源的甲基化检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，制备链霉亲和素磁珠悬浮液，在链霉亲和素磁珠悬浮液中加入MBD蛋白，室温旋转孵育后洗涤后重悬，得到磁珠
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蛋白混合物；步骤2，提取得到cfDNA，再加入至步骤1中得到的磁珠
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蛋白混合物中，孵育后并洗涤；步骤3，对步骤2中的分离得到的磁珠进行洗脱，采用的洗脱液是NaCl溶液，洗脱过程步骤是先进行第一浓度洗脱，再进行第二浓度洗脱，收集全部洗脱液；所述的第一浓度是400
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600mM，第二浓度是800
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1200mM；步骤4，洗脱液中加入醋酸钠溶液、无水乙醇和糖原，使析出沉淀，经过分离、洗涤、干燥、复溶后，得到富集的DNA；步骤5，对步骤4中得到的富集的DNA进行测序，并进行甲基化分析。2.根据权利要求1所述的肺癌血浆游离DNA来源的甲基化检测方法，其特征在于，所述的步骤1中，磁珠
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蛋白混合物以100μL计，其中含有5
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15μL MBD蛋白和5
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15μL链霉亲和素磁珠。3.根据权利要求1所述的肺癌血浆游离DNA来源的甲基化检测方法，其特征在于，所述的步骤2中，cfDNA与磁珠
‑
蛋白混合物的配比是：10
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20ng:4
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10μL。4.根据权利要求1所述的肺癌血浆游离DNA来源的甲基化检测方法，其特征在于，所述的步骤3中，第一浓度洗脱次数1
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3次，第二浓度洗脱次数2
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4次。5.根据权利要求1所述的肺癌血浆游离DNA来源的甲基化检测方法，其特征在于，所述的步骤4中，醋酸钠溶液与洗脱液的体积比、无水乙醇与洗脱液的体积比分别为1：8
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12、...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵阳，陈硕，常双，江雅，刘思思，张安笃，程曦，唐元斌，那成龙，
申请(专利权)人：南京世和医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：