一种基于靶向HPV的宫颈癌患者治疗后的微小残留病灶的NGS检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术属于靶向二代测序领域，具体涉及基于高通量测序检测HPV的二代测序探针组及其方法。尤其适用于检测宫颈癌患者治疗后血浆中含有的低丰度HPV序列。能够对目标区域进行更好的捕获和覆盖，获得在目标区域上的足够的读段数据信息，从而对其MRD与治疗预后进行评估。从而对其MRD与治疗预后进行评估。从而对其MRD与治疗预后进行评估。

【技术实现步骤摘要】
一种基于靶向HPV的宫颈癌患者治疗后的微小残留病灶的NGS检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于靶向二代测序领域，具体涉及基于高通量测序检测HPV的二代测序探针组及其方法。尤其适用于检测宫颈癌患者治疗后血浆中含有的低丰度HPV序列。

技术介绍

[0002]人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)是一种乳头瘤空泡病毒A属球形病毒，主要宿主为人类，可以引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。HPV通过与患有疾病的人进行性交进行传播，偶尔也会在生育时通过母婴传播方式扩散。在全球，约有5％的癌症与HPV感染相关，其中包括了近85％的宫颈癌，每年因HPV致癌的人数超过50万。
[0003]针对HPV E6和E7基因的扩增与测序是HPV诊断与基因分型的主要方法。HPV具有丰富的遗传多样性，目前已经发现了超过200种的HPV基因型，其中约有40种被证实与人类癌症相关。美国疾控中心根据HPV致宫颈癌的风险，将HPV分为了高风险型(High risk HPV,HR
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HPV)和低风险型(Low risk HPV，LR
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HPV)。导致女性宫颈癌的基因型主要为14种HR
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HPV，包括：HPV
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16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66和68，其中HPV16的感染流行率最高。
[0004]癌症中的微小残留病灶(Minimal residual disease,MRD)指癌症治疗达到完全缓解后，用常规的影像学方法无法检测到的癌病灶，而此时患者体内依然存在少量的癌细胞，最终可能会引起癌症的复发。近年来的研究表明，宫颈癌患者治疗后血浆中残留的HPV序列与宫颈癌的MRD密切相关，MRD的存在可提前预示宫颈癌的全面复发。因此，采用灵敏度高、特异性强及稳定可靠的实验方法对宫颈癌患者进行MRD检测，对评估癌症状态、判断疗效、预测复发、指导治疗具有重要的临床意义。
[0005]二代测序(Next generation sequencing,NGS)可以一次对一个样本的多个目标区域或者多个样本进行高通量的测序，其已逐渐被应用在肿瘤突变基因检测与临床病原微生物的检测上。二代测序的流程包括核酸提取、文库构建、上机测序和数据分析等步骤。
[0006]靶向测序目前主要有多重扩增子测序与探针杂交捕获测序两种方法。
[0007]多重扩增子测序通过使用引物组对核酸样本中的多个靶标进行PCR，对PCR产物进行二代测序。其流程包括：PCR、产物纯化、连接加接头、连接产物纯化等。多重扩增子测序的流程相对简单，但是受限于扩增引物的特异性与引物之间的相互干扰问题，其引物组能覆盖的测序范围十分有限，不适合对大片段的基因的测序。
[0008]探针杂交捕获测序是指通过设计特异性识别目标区域的探针组，对NGS文库中的目的区域进行特异性结合然后捕获的过程。其流程包括：核酸片段化
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末端修复
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接头连接
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建库后扩增与纯化
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探针杂交
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磁珠捕获
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磁珠洗涤
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富集后扩增与纯化等。探针杂交捕获流程操作复杂、流程较长，但是其捕获的探针组之间可以相互兼容、易于扩展，可以对大片段的基因进行测序。但是，如何能够有效地设计杂交捕获探针，对目标序列进行有效的覆盖，并避免由AT、GC含量影响而导致的信息丢失，仍然是实际检测过程中需要解决的问题。

技术实现思路

[0009]本专利技术提供一种探针杂交捕获法NGS检测宫颈癌患者治疗后血浆中的HPV序列，能够对目标区域进行更好的捕获和覆盖，获得在目标区域上的足够的读段数据信息，从而对其MRD与治疗预后进行评估。
[0010]一种基于靶向HPV的宫颈癌患者治疗后的微小残留病灶的NGS检测方法，包括如下步骤：
[0011]步骤1，对样本血浆cfDNA进行提取；
[0012]步骤2，构建测序文库；
[0013]步骤3，将文库与探针组进行液相杂交后，进行磁珠捕获；
[0014]步骤4，对捕获后的片段进行高通量测序；
[0015]步骤5，测序结果对比对参考基因组，并对HPV基因分型进行确定。
[0016]所述的探针组中包含有正链探针组和/或负链探针组，正链探针组中包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1
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120所示的探针，负链探针组中包含核苷酸序列如SEQ ID NO.121
‑
218所示的探针。
[0017]所述的液相杂交过程中，探针组在反应液中的浓度0.01
‑
4pmol。
[0018]所述的磁珠捕获过程中，体系温度60
‑
65℃。
[0019]所述的探针的5
’
端有生物素(Biotin)修饰。
[0020]所述的检测方法用于非治疗与诊断目的。
[0021]一种试剂盒，用于靶向HPV的宫颈癌患者治疗后的微小残留病灶的NGS检测，其中包含包含有正链探针组和/或负链探针组，正链探针组中包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1
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120所示的探针，负链探针组中包含核苷酸序列如SEQ ID NO.121
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218所示的探针。
[0022]有益效果
[0023]本专利技术的方法能够成功地对血浆cfDNA中的HPV微量残留序列进行检测，其检测灵敏度能够达到0.112copies/ng。
附图说明
[0024]图1.探针捕获法检测HPV的实验流程
[0025]图2.五个拷贝数梯度下5个重复样本的HPV检测结果(dedup reads数)
[0026]图3.HPV
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seq对于不同HPV基因型的探针覆盖情况。图中，横轴为探针覆盖HPV的基因组的位置，纵轴为探针覆盖区域去重后的测序深度。
具体实施方式
[0027]二代测序(Next generation sequencing,NGS)可以一次对一个样本的多个目标区域或者多个样本进行高通量的测序，其已逐渐被应用在肿瘤突变基因检测与临床病原微生物的检测上。二代测序的流程包括核酸提取、文库构建、上机测序和数据分析等步骤。
[0028]本专利技术的目标HPV分型包括有：HPV16、HPV18、HPV58、HPV52、HPV33、HPV31HPV59、HPV39、HPV45、HPV51、HPV56、HPV68、HPV35、HPV66。
[0029]在液相捕获探针的设计的过程中，基因组DNA中重复序列的封闭不充分及基因组DNA与捕获探针的比例不合适等因素都会影响捕获的特异性、敏感性、测序覆盖率等诸多结
果，需要对探针的类型、长度、序列、杂交条件等进行大量实验摸索，需要通过创造性的探索工作才能够获得最佳的参数组合，如果探针特异性太高，在DNA捕获时就会产生有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于靶向HPV的宫颈癌患者治疗后的微小残留病灶的NGS检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，对样本血浆cfDNA进行提取；步骤2，构建测序文库；步骤3，将文库与探针组进行液相杂交后，进行磁珠捕获；步骤4，对捕获后的片段进行高通量测序；步骤5，测序结果对比对参考基因组，并对HPV基因分型进行确定；所述的探针组中包含有正链探针组和/或负链探针组，正链探针组中包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1
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120所示的探针，负链探针组中包含核苷酸序列如SEQ ID NO.121
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218所示的探针。2.根据权利要求1所述的基于靶向HPV的宫颈癌患者治疗后的微小残留病灶的NGS检测方法，其特征在于，所述的液相杂交过程中，探针组在反应液中的浓度0.01
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4pmol。3.根据权利要求1所述的基于靶向...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘思思，邵阳，蒋文，吴雪，那成龙，何鹏，杨珊珊，郑丽娟，
申请(专利权)人：南京世和医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：