基因标志物在非小细胞肺癌复发预测中的应用、微小残留病灶的检测方法和预测装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种基因标志物在非小细胞肺癌复发预测中的应用、微小残留病灶的检测方法和预测装置,属于分子生物医学技术领域，通过对血浆样本cfDNA进行液体活检全基因组WGS低深度测序，通过对非小细胞肺癌癌细胞切除术后病人在术后的血液样本进行低通量测序，利用测序结果中的DNA碎片化片段长短比例，进行正则化比例风险模型（Regularized Cox Regression）构建，检测术后病人在术后肿瘤微小残留病灶（minimal residual disease,MRD），实现对非小细胞肺癌切除术后复发风险的早期无创精准预测，对术后辅助治疗提供指导性作用。用。用。

【技术实现步骤摘要】
基因标志物在非小细胞肺癌复发预测中的应用、微小残留病灶的检测方法和预测装置


[0001]本专利技术涉及一种基因标志物在非小细胞肺癌复发预测中的应用、微小残留病灶的检测方法和预测装置，属于分子生物医学


技术介绍

[0002]非小细胞肺癌是最常见的肺癌类型之一。在接受肿瘤切除手术后，大约有30%
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50%非小细胞肺癌患者在术后会发生复发或转移，这可能是由于术后患者体内仍然存在影像学或实验方法无法检测到的微小残留病灶（MRD），这些肿瘤复发的潜在来源与患者较差的预后有着紧密的关系。研究表明，早期非小细胞肺癌患者在肿瘤切除手术后，MRD阳性的患者复发风险相对较高。因此，非小细胞肺癌术后的微小残留病灶的监测测对肿瘤复发风险评估和临床预后治疗十分重要。现存的仅依靠循环肿瘤基因组突变分析检测方法（target
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sequencing based ctDNA mutation method），在对微小残留病灶（MRD）的检测中，存在低敏感性问题。特别是在对术后早期的微小残留病灶的检测，这种传统的循环肿瘤基因组突变检测方法的灵敏度普遍较低。因此，临床上对高灵敏度的微小残留病灶的早期检测有迫切需求, 通过对术后早期的微小残留病灶的检测，实现对复发风险的预测。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供了一种对非小细胞肺癌患者术后血浆样本cfDNA进行WGS测序，通过高通量低深度的测序结果，获取DNA片段化信息，统计在不同纵向时间下，在不同碱基对长度峰值下的短片段与长片段的比值（Fragment Size Ratio, FSR），分别利用术后7天以及术后6个月的片段比值特征，建立正则化Cox比例风险模型（Regularized Cox Regression）, 利用留一法交叉验证（leave one out）训练并验证模型，计算出每个患者的复发概率。实现对高风险复发患者和低风险复发患者的区分，对临床预后治疗有重要的指导性作用。
[0004]检测基因标志物的试剂在用于制备非小细胞肺癌术后复发预测试剂中的应用，所述的基因标志物是指cfDNA中第一、第二、第三、第四片段在全部片段中所占的比例；所述的第一、第二、第三、第四片段分别具有151
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220bp、311
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400bp、100
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150bp和221
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300bp的碱基长度。
[0005]所述的cfDNA来源于患者术后第7天
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第6个月的血浆。
[0006]一种非小细胞肺癌术后复发预测模型的构建方法，包括如下步骤：步骤1，从患者术后血浆中提取cfDNA，进行测序，并比对于参考基因组，获得其在参考基因组上的位置，以及获得各个cfDNA片段的长度；步骤2，将参考基因组划分为多个窗口，分别统计出比对于各个窗口中的第一、第二、第三、第四片段的cfDNA在该窗口中全部cfDNA片段中的比例，作为第一、第二、第三、第三特征值；第一、第二、第三、第四片段分别具有151
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220bp、311
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400bp、100
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150bp和221
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300bp的碱基长度；
步骤3，分别将各个窗口中的第一、第二、第三、第四特征值作为Cox比例风险回归模型的自变量，建立发生生复发风险概率的模型。
[0007]所述的步骤1中，从患者术后血浆中提取cfDNA是在患者术后第7天
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第6个月内进行。
[0008]所述的步骤2中，将参考基因组划分为多个窗口是以5Mb为长度进行划分。
[0009]所述的步骤3中，Cox比例风险回归模型中进行正则化处理。
[0010]一种非小细胞肺癌术后复发预测装置，包括：提取模块，用于从患者术后血浆中提取cfDNA；测序模块，用于对提取cfDN进行测序，并比对于参考基因组，获得其在参考基因组上的位置，以及获得各个cfDNA片段的长度；统计模块，用于将参考基因组划分为多个窗口，分别统计出比对于各个窗口中的第一、第二、第三、第四片段的cfDNA在该窗口中全部cfDNA片段中的比例，作为第一、第二、第三、第三特征值；第一、第二、第三、第四片段分别具有151
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220bp、311
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400bp、100
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150bp和221
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300bp的碱基长度；预测模块，分别将各个窗口中的第一、第二、第三、第四特征值作为Cox比例风险回归模型的自变量，建立发生生复发风险概率的模型。
[0011]一种计算机可读取介质，其记载有能够运行以下非小细胞肺癌术后复发预测步骤的计算机程序：步骤1，对患者术后血浆中提取cfDNA进行测序，并比对于参考基因组，获得其在参考基因组上的位置，以及获得各个cfDNA片段的长度；步骤2，将参考基因组划分为多个窗口，分别统计出比对于各个窗口中的第一、第二、第三、第四片段的cfDNA在该窗口中全部cfDNA片段中的比例，作为第一、第二、第三、第三特征值；第一、第二、第三、第四片段分别具有151
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220bp、311
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400bp、100
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150bp和221
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300bp的碱基长度；步骤3，分别将各个窗口中的第一、第二、第三、第四特征值作为Cox比例风险回归模型的自变量，建立发生生复发风险概率的模型；步骤4，将待测样本执行步骤1
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步骤2，将结果输入至步骤3中获得的模型中，计算出复发风险概率。
[0012]有益效果对87个非小细胞肺癌患者肿瘤切除术后7天及76个患者术后6个月的WGS cfDNA片段化长度比例进行统计和分析，训练正则化比例风险模型。本专利技术首次基于血浆cfDNA高通量低深度测序的片段化结果进行对非小细胞肺癌的微小残留病灶的检测，并利用术后不同的纵向时间点的样本对复发风险进行预测。该模型比现存的仅依靠循环肿瘤基因组突变分析检测方法具有更高的灵敏性，能更有效地对术后高风险复发人群和低风险复发人群进行分类，对术后辅助治疗有重要的指导作用。
附图说明
[0013]图1是模型构建过程示意图；图2是cfDNA的片段大小分布图；
图3 是利用留一法验证的术后7天样本的模型和术后6个月样本模型的AUC曲线图；图4是复发和非复发患者在术后7天样本模型和术后6个月样本模型所预测出的分数分布；图5是根据术后7天样本的模型分类结果和术后6个月样本的模型分类结果的高风险复发人群和低风险复发人群的生存曲线图；图6是术后7天样本模型及术后6个月样本模型的灵敏度和特异性图。
具体实施方式
[0014]本专利技术首先需要对血液样本中对cfDNA的提取，建库，测序等步骤；本专利技术使用 DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen）从血浆样本中提取基因组DNA，再使用Qubit 3.0 荧光计和dsDNA HS Assay本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测基因标志物的试剂在用于制备非小细胞肺癌术后复发预测试剂中的应用，其特征在于，所述的基因标志物是指cfDNA中第一、第二、第三、第四片段在全部片段中所占的比例；所述的第一、第二、第三、第四片段分别具有151
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220bp、311
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400bp、100
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150bp和221
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300bp的碱基长度。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的cfDNA来源于患者术后第7天
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第6个月的血浆。3.一种非小细胞肺癌术后复发预测模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，从患者术后血浆中提取cfDNA，进行测序，并比对于参考基因组，获得其在参考基因组上的位置，以及获得各个cfDNA片段的长度；步骤2，将参考基因组划分为多个窗口，分别统计出比对于各个窗口中的第一、第二、第三、第四片段的cfDNA在该窗口中全部cfDNA片段中的比例，作为第一、第二、第三、第三特征值；第一、第二、第三、第四片段分别具有151
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220bp、311
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400bp、100
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150bp和221
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300bp的碱基长度；步骤3，分别将各个窗口中的第一、第二、第三、第四特征值作为Cox比例风险回归模型的自变量，建立发生生复发风险概率的模型。4.根据权利要求3所述的非小细胞肺癌术后复发预测模型的构建方法，其特征在于，所述的步骤1中，从患者术后血浆中提取cfDNA是在患者术后第7天
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第6个月内进行。5.根据权利要求3所述的非小细胞肺癌术后复发预测模型的构建方法，其特征在于，所述的步骤2中，将参考基因组划分为多个窗口是以5Mb为长度进行划分。6.根据权利要求3所述的非小细胞肺癌术后复发预测模型的构建方法，其特征在于，所述的步骤3中，Cox比...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵阳，吴雪，包华，刘睿，吴舒雨，唐皖湘夫，刘思思，
申请(专利权)人：南京世和医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：