用于宫颈癌早期检测的DNA甲基化生物标志物制造技术

本发明专利技术公开了一种用于获得DNA甲基化生物标志物作为人基因组中的精确DNA甲基化位置(即CGID)的体外方法，所述体外方法是通过检查从CIN1发展到CIN3的癌前病变(宫颈上皮内赘瘤形成(CIN))三个阶段中“分类”DNA甲基化改变的发展来预测宫颈癌，尤其在目前尚未达到的早期阶段如此。本发明专利技术公开了CGID的组合，其用于通过测量它们的DNA甲基化状态并得出“甲基化得分”来检测高特异性和高敏感性宫颈癌，所述“甲基化得分”可用作宫颈癌生物标志物。还公开了使用多元下一代测序甲基化测定、焦磷酸测序测定和甲基化特异性PCR使用所述CGID预测宫颈癌的试剂盒。本发明专利技术中描述的DNA甲基化标志物(CGID)可用于由所属领域的任何技术人员进行的用于检测宫颈癌的宫颈筛查和宫颈癌的早期检测。检测。检测。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于宫颈癌早期检测的DNA甲基化生物标志物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请根据第119(e)条要求2018年12月4日提交的标题为“用于宫颈癌早期检测的DNA甲基化标志物(DNA METHYLATION MARKERS FOR EARLY DETECTION OF CERVICAL CANCER)”的美国临时申请序列第62/774,994号的优先权，该临时申请的内容通过引用并入本文。
[0003]序列列表
[0004]本申请含序列表，其以ASCII格式以电子方式提交的，并且通过引用整体并入本文。2020年1月12日创建的所述ASCII副本被命名为TPC53811 Seq List_ST25.txt，大小为36,864字节。


[0005]本专利技术大体涉及人DNA中的DNA甲基化签名，特别是在分子诊断领域中。更具体地，本专利技术是用于宫颈癌的早期检测以及筛查的一组、个体以及多基因DNA甲基化生物标志物的组合形式的DNA甲基化生物标志物，以及它们作为用于宫颈癌的早期和准确检测的诊断试剂盒的用途。

技术介绍

[0006]癌症已经成为人类的主要杀手。癌症的早期检测可以显着提高治愈率，并降低患者、其家人和保健系统可怕的个人和经济成本。同时，筛查健康个体以评估癌前阶段生物标志物表达及其改变在全群体筛查方法中是有用的，并且有助于确定风险较大、易患癌症的健康个体。宫颈癌也不例外。筛查可以在癌症可引发症状之前的早期阶段确定癌症。如果宫颈癌在其最早阶段被发现，则存活的机会为约93％，而其在最晚阶段降至15％https://www.cancer.org/cancer/cervical
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cancer/detection
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diagnosis
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staging/survival.html。目前的筛查方法包括巴氏涂片、液基细胞学、HPV测试和目视检查，然而缺乏稳健、高度准确和灵敏的宫颈癌早期检测方法。
[0007]生物标志物构成癌症诊断的最重要领域之一。癌症生物标志物对于疾病的早期检测或诊断尤其有用。生物标志物可用于筛查患者、对癌症的不同阶段或级别进行分类以及预测预后和对疗法的抗性。
[0008]人类乳头瘤病毒(HPV)作为宫颈赘瘤形成病原体的明确发现，从二级(HPV分子测试)角度彻底改变了这种妇科疾病的预防和管理模式(1)。了解HPV基因型确实有助于临床预测，这是因为HPV 16和/或18型与其他致癌类型相比，与更大的病变发展风险相关联。然而，致癌HPV基因型的持续性感染是宫颈癌变的必要前体和驱动力。后者表示从癌前阶段(宫颈上皮内瘤病变，CIN)到浸润性宫颈癌的逐步发展。低级别CIN病(CIN1)明显可逆，而2级和3级高级别CIN(即，分别为CIN2和CIN3)发展为侵袭即宫颈癌的风险不可忽略。对于CIN3尤其如此。
[0009]在诊所中管理患有CIN病的女性仍然是妇科医生面临的重大难题，因为当女性患
者决定怀孕时，积极的消融或切除治疗可能会立即导致并发症，或增加日后流产或早产的风险。最近的证据表明，特定基因的表观遗传变化可能介导或预测致癌发展。由于显着变化(包括表观遗传学水平的生化变化)，癌症早期检测生物标志物可以在分类上区分无症状阶段和癌前阶段有病变的罕见细胞。作为生物标志物的这些表观遗传变化经常在癌组织中异常大量地产生，并且经常妨碍疾病本身的表现。要在疾病开始和发展之前早早地确定分子变化背景，分子生物标志物的开发是极其重要的。其中一种表观遗传生物标志物，病毒和宿主基因中某些CpG位点的DNA甲基化水平，显示随着潜在宫颈病变的严重程度而增加(2
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7)。
[0010]在具有与宫颈癌和其前体相关的表观遗传变化的研究最多和靶向最多的宿主基因中的是细胞粘附分子1(CADM1)；死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)；髓鞘和淋巴细胞，T细胞分化蛋白(MAL)；配对盒1(PAX1)；端粒酶逆转录酶(TERT)；红细胞膜蛋白带4.1样3(EPB41L3)，Ras关联结构域家族成员1(RASSF1)；SRY
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盒1(SOX1)；钙粘蛋白1(CDH1)；LIM同源盒转录因子1α(LMX)；细胞周期蛋白A1(CCNA1)；序列相似性家族19成员A4，C
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C基序趋化因子样(FAM19A4)；以及视黄酸受体β(RARβ)8。除了包括两个(即CADM1和MAL(3，4，10)；MAL和miR124
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2(11
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14)，三个(即CADM1、MAL和miR124
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2)(13，15)、四个(即JAM3、EPB41L3、TERT和C130RF18)(16，17)和五个(即PAX1、DAPK1、RARβ、WIF1和SLIT2)(14)标志物组以及涉及SOX1、PAX1、LMX1A和NKX6
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1标志物的各种组合的组的那些外，还研究了单个(9)甲基化标志物，以获得足够高的晚期病变敏感性(18)。
[0011]然而，仅一项使用全基因组甲基化途径的前期研究确定了具有最高联合诊断准确性的三个甲基化组(JAM3/ANKRD18CP、C13ORF18/JAM3/ANKRD18CP和JAM3/GFRA1/ANKRD18CP)，用于检测宫颈样品中的CIN2+；并且敏感性分别被报告为72％、74％和73％，且相应特异性分别为79％、76％和77％(2)。因此，需要确定DNA甲基化生物标志物、与宫颈癌的早期检测和风险预测相关的DNA甲基化生物标志物组以及基于这种生物标志物的试剂盒的改进方法，用于针对宫颈癌的早期检测和易感性全群体筛查明显健康的女性且用于具有癌前病变的女性的风险评估。
[0012]本专利技术通过使用DNA甲基化生物标志物作为基于单一的、组合的以及组的生物标志物，提供与缺乏宫颈癌的早期检测标志物相关的问题的解决方案，因为目前缺乏对早期阶段宫颈癌的风险预测具有适当诊断性能的单一的或组合的甲基化标志物。本专利技术公开了一种用于获得癌前病变发展为宫颈癌的早期生物标志物的方法，所述方法可用于在无症状以及表现出CIN1至CIN3病理的女性中进行一般筛查。
[0013]专利技术目的
[0014]本专利技术的主要目的涉及用于人宫颈癌的早期检测和诊断的生物标志物。
[0015]本专利技术的进一步目的涉及本文公开的称为“进行性DNA甲基化改变分析(APDMA)”的体外方法，所述方法涉及以下步骤：相较于来自女性的健康对照标本，检查来自具有不同CIN级病理(CIN1至CIN3)的女性的标本的DNA甲基化的全基因组谱，以获得CGID作为DNA甲基化生物标志物，所述生物标志物当组合时使用本文公开的线性回归模型，预测在公开可得的宫颈癌甲基化谱中具有>95％敏感性和特异性的宫颈癌。
[0016]本专利技术的另一个目的涉及分子生物标志物，作为女性全群体筛查的指示符，用于宫颈癌的早期检测以及具有CIN1至CIN3病理的女性的风险评估。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于获得宫颈癌的早期预测因子的体外方法，所述方法包含以下步骤：(a)测量宫颈标本样品的DNA甲基化，(b)对步骤a中获得的所述DNA甲基化测量结果执行统计分析，(c)通过对步骤b中获得的全基因组DNA甲基化谱执行进行性DNA甲基化改变分析(APDMA)来确定称为CG标识符(CGID)的多个独立基因组CG位置的DNA甲基化状态，(d)基于与宫颈癌癌前阶段发展相关的CGID的DNA甲基化频率对CGID进行分类，以及(e)从步骤d中的分类中获得候选CGID以获得呈DNA甲基化生物标志物形式的宫颈癌的早期预测因子。2.根据权利要求1所述的方法，所述测量DNA甲基化是使用包含以下的方法执行：Illumina 27K、450K或850K阵列、在包括HiSeq、MiniSeq、MiSeq或NextSeq测序仪的平台上进行的全基因组亚硫酸氢盐测序、torrent测序、甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)测序、与寡核苷酸阵列的杂交、DNA焦磷酸测序、基于质谱分析的甲基化测定(Epityper
TM
)或基于PCR的甲基化测定。3.根据权利要求1所述的方法，对所述DNA甲基化测量结果进行的所述统计分析包括皮尔逊相关性、接收器操作特性(ROC)测定和层次聚类分析。4.根据权利要求1所述的方法，所述宫颈癌癌前阶段发展包含在CIN1、CIN2和CIN3阶段的宫颈上皮内赘瘤形成病变。5.根据权利要求1所述的方法，基于与宫颈癌癌前阶段发展相关的所述CGID的DNA甲基化频率的所述CGID选自以下群组：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:79及其组合中所阐述的CGID。6.根据权利要求1所述的方法，所述候选CGID作为呈DNA甲基化生物标志物形式的所述宫颈癌的早期预测因子，其中所述CGID选自以下群组：SEQ ID NO:3、SEQ NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:70及其组合中所阐述的CGID。7.一组用于宫颈癌筛查和早期检测的DNA甲基化生物标志物，其中所述组包含通过APDMA方法得出的CGID，所述CGID具有选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:79及其组合，并且任选地，所述组与其他生物标志物组合用作宫颈癌的早期预测因子。8.一种用于宫颈癌筛查和早期检测的DNA甲基化生物标志物的组合，所述组合包含使用APDMA方法得出的CGID，所述APDMA方法是用于通过测量源自宫颈标本的DNA中的所述CGID的DNA甲基化水平并使用线性回归方程和接收器操作特性(ROC)测定得出“宫颈癌甲基化预测因子”来检测宫颈癌，其中所述CGID选自以下群组：SEQ ID NO:3、SEQ NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:70...

【专利技术属性】
技术研发人员：莫西，
申请(专利权)人：香港精准医学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：