一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基及方法技术

本发明专利技术公开了一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基及方法，涉及一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基，包括包被液、刺激培养基和扩增培养基，包被液包括DPBS磷酸缓冲液、NKp46和CD137，刺激培养基包括K581基础培养基、IL

【技术实现步骤摘要】
一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基及方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养领域，特别涉及一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基及方法。

技术介绍

[0002]NK细胞是体内负责杀伤老化、受病毒感染、肿瘤等异常细胞的最主要“战士”。它不需要接受免疫系统的特殊指令，自己单独就能识别和攻击外来细胞、癌细胞和病毒。有研究表明：年龄超过100岁的老年人也可以有效抵抗感染，因为其NK细胞系统功能完好，而NK细胞受损的老年人易于感染流感、结核等疾病。由此可见，NK细胞尤其在维持老年人健康，保持抗感染和抗肿瘤功能中发挥着不可替代的作用。
[0003]在日本，NK细胞回输作为肿瘤治疗和抗衰保健的有效手段已经常态化；在美国，有关NK细胞的研究如火如荼；在国内，NK细胞也已走上临床研究之路。临床研究发现NK细胞过继免疫治疗恶性肿瘤具有良好的应用前景，对多种实体瘤和血液系统恶性肿瘤均有一定效果。
[0004]现有的NK细胞的制备，价格高昂，并且通常外周血与不同的基质细胞共同培养，如K562细胞等，直接刺激激活NK细胞达到NK细胞扩增的目的；然而方法中使用K562细胞具有未知风险，安全性低。有效发展肿瘤过继细胞免疫治疗的关键，是如何获得高质量且安全的可以应用于临床的NK细胞是目前需要解决的主要问题。

技术实现思路

[0005]基于此，本专利技术提供了一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基及方法，本专利技术避免了NK细胞与其它来源细胞共培养的问题，在降低成本的基础上还可以获得大量的高纯度高功能的NK细胞。
[0006]本专利技术提供了如下的第一个技术方案：
[0007]本专利技术涉及一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基，包括包被液、刺激培养基和扩增培养基，所述包被液包括DPBS磷酸缓冲液、NKp46和CD137，所述刺激培养基包括K581基础培养基、IL
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2、IL
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18、IL
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15、IL
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21、OK432、IFN
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γ、NEAA、谷氨酰胺、PHA和自体灭活血浆，所述扩增培养基包括K581基础培养基、IL
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2和AB血清。
[0008]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述包被液中NKp46、CD137的终浓度为1
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5ug/mL，所述刺激培养基中IL
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2的终浓度为1000
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2000U/mL、IL
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18的终浓度为5
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20ng/mL、IL
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15的终浓度为5
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20ng/mL、IL
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21的终浓度为5
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20ng/mL、OK432的终浓度为50
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200ng/mL、IFN
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γ的终浓度为50
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200ng/mL、PHA的终浓度为0.1
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1ug/mL、NEAA的终浓度为1％、谷氨酰胺的终浓度为1％、自体灭活血浆的体积分数为10％，所述扩增培养基中IL
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2的终浓度为500
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1000U/mL、AB血清的体积分数为10％。
[0009]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述包被液中NKp46、CD137的终浓度比为1∶1，所述刺激培养基中IL
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2、IL
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18、IL
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15、IL
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21、OK432、IFN
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γ和PHA的终浓度比为10∶1∶1∶1∶
10∶10∶0.02。
[0010]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述包被液中NKp46的终浓度为3ug/mL、CD137的终浓度为3ug/mL，所述刺激培养基中IL
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2的终浓度为1000U/mL、IL
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18的终浓度为10ng/mL、IL
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15的终浓度为10ng/mL、IL
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21的终浓度为10ng/mL、OK432的终浓度为100ng/mL、IFN
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γ的终浓度为100ng/mL、PHA的终浓度为0.5ug/mL，所述扩增培养基中IL
‑
2的终浓度为800U/mL。
[0011]本专利技术提供了如下的第二个技术方案：
[0012]本专利技术还提供了一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的方法，步骤如下：
[0013]A：包被阶段：包被液包被需要使用的NK扩增培养瓶；
[0014]B：刺激阶段：刺激培养基刺激NK细胞；
[0015]C：扩增阶段：扩增培养基扩增NK细胞。
[0016]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述提前一天使用包被液包被NK扩增瓶在4℃包被1天。
[0017]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述包被阶段的包被液包被的的第0天至第1天，不适用任何培养基,刺激阶段使用刺激培养基激活NK细胞，从第1天至第4天，期间不换液，扩增阶段使用扩增培养基扩增NK细胞，从第4天开始，隔1天对细胞进行计数并补加培养基。
[0018]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述单个核细胞接种量为1
×
106‑2×
106/ml，起始接种5ml。
[0019]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述外周血也包括脐带血。
[0020]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0021]本专利技术避免了NK细胞与其它来源细胞共培养的问题，避免了一部分污染源，使得到的细胞不存在未知风险，更为安全；同时通过采用包被、刺激两个阶段，合理、逐步地激活NK细胞，再通过扩增阶段达到大量扩增NK细胞的目的，整个过程简单且高效。
附图说明
[0022]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。
[0023]其中附图中相同的标号全部指的是相同的部件。
[0024]此外，如果已知技术的详细描述对于示出本专利技术的特征是不必要的，则将其省略。需要说明的是，下面描述中使用的词语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”和“下”指的是附图中的方向，词语“内”和“外”分别指的是朝向或远离特定部件几何中心的方向。
[0025]在附图中：
[0026]图1是流式检测实施例及其对比组的CD3
‑
CD56+阳性率的结果图；
[0027]图2是流式检测阴性组的CD3
‑
CD56+阳性率的结果图；
[0028]图3是实施例及其对比组扩增曲线；
[0029]图4实施例及其对比组扩增倍数柱状图；
具体实施方式
[0030]以下结合附图对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0031本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基，其特征在于，包括包被液、刺激培养基和扩增培养基，所述包被液包括DPBS磷酸缓冲液、NKp46和CD137，所述刺激培养基包括K581基础培养基、IL
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2、IL
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18、IL
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15、IL
‑
21、OK432、IFN
‑
γ、NEAA、谷氨酰胺、PHA和自体灭活血浆，所述扩增培养基包括K581基础培养基、IL
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2和AB血清。2.根据权利要求1所述的一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基，其特征在于，所述包被液中NKp46、CD137的终浓度为1
‑
5ug/mL，所述刺激培养基中IL
‑
2的终浓度为1000
‑
2000U/mL、IL
‑
18的终浓度为5
‑
20ng/mL、IL
‑
15的终浓度为5
‑
20ng/mL、IL
‑
21的终浓度为5
‑
20ng/mL、OK432的终浓度为50
‑
200ng/mL、IFN
‑
γ的终浓度为50
‑
200ng/mL、PHA的终浓度为0.1
‑
1ug/mL、NEAA的终浓度为1％、谷氨酰胺的终浓度为1％、自体灭活血浆的体积分数为10％，所述扩增培养基中IL
‑
2的终浓度为500
‑
1000U/mL、AB血清的体积分数为10％。3.根据权利要求1所述的一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基，其特征在于，所述包被液中NKp46、CD137的终浓度比为1∶1，所述刺激培养基中IL
‑
2、IL
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【专利技术属性】
技术研发人员：曹哲厚，吴立前，马悦悦，
申请(专利权)人：杭州原生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：