一种抗HBV的混合免疫细胞制剂及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种抗HBV的混合免疫细胞制剂及其制备方法，通过先培养HBV

【技术实现步骤摘要】
一种抗HBV的混合免疫细胞制剂及其制备方法


[0001]本专利技术属于免疫细胞体外培养
，具体涉及一种抗HBV的混合免疫细胞制剂及其制备方法。

技术介绍

[0002]人类感染乙肝病毒后的转归取决于机体的免疫应答状态和感染病毒的量及其免疫原性的强度，机体免疫应答方面，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应起决定作用，CTL具有识别和杀伤感染HBV细胞的功能，在控制HBV感染方面起主要作用，HBV感染者体内CTL反应的质量和数量决定人类感染乙肝病毒后的转归。人感染乙肝病毒后，如果病毒量及其免疫原性强度高，而且机体内CTL的数量和功能足够强，就会发生急性肝炎反应，患者体内发生强烈的、多向T细胞应答现象，CTL识别抗原并将攻击感染的肝细胞，致使肝细胞凋亡坏死，形成急性肝炎的特征性病变，最终结局是病毒被清除。
[0003]慢性乙肝的形成与以下两方面原因有关。第一，被感染者体内CTL数量减少，功能减弱，不足以针对乙肝病毒抗原发生足够能力的免疫应答反应，所以没有能力清除感染的病毒，长期的病毒抗原刺激和CTL无反应状态导致了免疫耐受的形成。第二，体内持续、少量、反复地被乙肝病毒感染，或急性期病毒残留，导致CTL耗竭和失能，形成慢性乙肝。
[0004]CTL反应的数量和质量是急、慢性乙肝转归的决定因素。患者体内CTL对HBV应答的强度取决于CTL反应的数量和质量，只有足够强度的CTL反应才可以清除HBV。如何恢复慢性乙型肝炎(CHB)患者CTL的数量和免疫应答功能是从根本上治疗CHB的关键。目前现有的CTL体外培育方法，普遍存在扩增CTL倍率低，细胞杀伤活动差等问题。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术存在的以上问题，本专利技术提供了一种抗HBV的混合免疫细胞制剂及其制备方法。本专利技术以脐带血为处理对象，脐带血单个核细胞通过添加CD3、PHA、IL
‑
7、IL
‑
2进行激活和持续刺激成CTL细胞，同时添加成熟的DC负载HBV疫苗与CTL细胞混合培养，能有效提高HBV
‑
CTLs的扩增能力、表型、免疫应答能力和急体外杀伤能力。
[0006]本专利技术所采用的技术方案为：
[0007]一种抗HBV的混合免疫细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0008](1)HBV
‑
DC细胞培养
[0009](S1)培养第0天，取脐带血单个核细胞的浓度为5
×
106/ml
‑1×
107/ml重悬于DC初始培养基中，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育2.5
‑
4h；将悬浮T细胞取出，用DC初始培养基滴洗两遍，直至悬浮细胞比例低于5％；在贴壁细胞中加入DC培养基20ml，置于37℃、5％CO2培养箱中；
[0010](S2)培养第4天，加DC培养基20mL，置于37℃、5％CO2培养箱中；
[0011](S3)培养第6天，加入DC诱导成熟培养基20ml，置于37℃、5％CO2培养箱中；
[0012](S4)培养第7天，成熟DC加入乙肝疫苗后，在37℃、5％CO2培养箱中孵育，4h后离心
洗涤重悬，收获成熟的HBV
‑
DC，用力冲洗皿底收集细胞，离心，重悬并计数，完成HBV
‑
DC细胞的培养；
[0013](2)脐带血CTL培养
[0014](SS1)培养第0天，取制备好的脐带血单个核细胞(MNC)2.5
×
107个，接种到T175培养瓶内，加20mL CTL初始培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中；
[0015](SS2)培养第3天，加CTL培养基20mL，置于37℃、5％CO2培养箱中；
[0016](SS3)培养第4天，加CTL培养基40mL，置于37℃、5％CO2培养箱中；
[0017](SS4)培养第5天，加CTL培养基120mL，置于37℃、5％CO2培养箱中；
[0018](SS5)培养第7天，收集CTL细胞，离心，重悬并计数，完成脐带血CTL的培养；
[0019](3)HBV
‑
CTLs培养
[0020](SSS1)培养第7天，HBV
‑
DC与CTL细胞全部混匀，按细胞浓度1
‑2×
106/ml加基础培养基并加1000IU/ml细胞因子IL
‑
2、2ng/ml的IL
‑
7细胞因子，共培养当天记为CTLs诱导培养的第7天。
[0021](SSS2)培养第9天，半量换液，补加基础培养基并补加1000IU/ml细胞因子IL
‑
2、2ng/ml的IL
‑
7细胞因子，调整细胞浓度为1
‑2×
106/ml继续培养，置于37℃、5％CO2培养箱中，调整细胞浓度为1
‑2×
106/ml继续培养；
[0022](SSS3)培养第11天，半量换液，补加基础培养基并补加细胞因子IL
‑
21000IU/ml、细胞因子IL
‑
7细胞因子的浓度为2ng/ml，调整细胞浓度为1
‑2×
106/ml继续培养，置于37℃、5％CO2培养箱中，调整细胞浓度为1
‑2×
106/ml继续培养；
[0023](SSS4)培养第14天，收获细胞，即得抗HBV的混合免疫细胞制剂。
[0024]所述DC初始培养基的组成为CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基和10％的血浆。
[0025]所述DC培养基的组成为CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基、1000IU/ml的GM
‑
CSF和1000IU/ml的IL
‑
4。
[0026]所述DC诱导成熟培养基为CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基、1000IU/ml的GM
‑
CSF、500IU/ml的IL
‑
4、10ug/ml乙肝疫苗和100IU/ml的IFN
‑
r。
[0027]步骤(S4)中，所述乙肝疫苗的加入量为10ug/ml；
[0028]进行离心的离心力为360g，离心时间为12min。
[0029]所述CTL初始培养基的组成为CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基、5％自体血浆、10ng/ml CD3、10μg/ml PHA、1000IU/ml的IL
‑
2、10ng/ml的IL
‑
7。
[0030]所述CTL培养基的组成为CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基、3％自体血浆、1000IU/ml的IL
‑
2、2ng/ml的IL
‑
7。
[0031]HBV
‑
CTLs培养时，所述基础培养基为CorningKB本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗HBV的混合免疫细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)HBV
‑
DC细胞培养(S1)培养第0天，取脐带血单个核细胞的浓度为5
×
106/ml
‑1×
107/ml重悬于DC初始培养基中，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育2.5
‑
4h；将悬浮T细胞取出，用DC初始培养基滴洗两遍，直至悬浮细胞比例低于5％；在贴壁细胞中加入DC培养基20ml，置于37℃、5％CO2培养箱中；(S2)培养第4天，加DC培养基20mL，置于37℃、5％CO2培养箱中；(S3)培养第6天，加入DC诱导成熟培养基20ml，置于37℃、5％CO2培养箱中；(S4)培养第7天，成熟DC加入乙肝疫苗后，在37℃、5％CO2培养箱中孵育，4h后离心洗涤重悬，收获成熟的HBV
‑
DC，用力冲洗皿底收集细胞，离心，重悬并计数，完成HBV
‑
DC细胞的培养；(2)脐带血CTL培养(SS1)培养第0天，取制备好的脐带血单个核细胞2.5
×
107个，接种到T175培养瓶内，加20mL CTL初始培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中；(SS2)培养第3天，加CTL培养基20mL，置于37℃、5％CO2培养箱中；(SS3)培养第4天，加CTL培养基40mL，置于37℃、5％CO2培养箱中；(SS4)培养第5天，加CTL培养基120mL，置于37℃、5％CO2培养箱中；(SS5)培养第7天，收集CTL细胞，离心，重悬并计数，完成脐带血CTL的培养；(3)HBV
‑
CTLs培养(SSS1)培养第7天，HBV
‑
DC与CTL细胞全部混匀，按细胞浓度1
‑2×
106/ml补充基础培养基并补加1000IU/ml细胞因子IL
‑
2、2ng/ml的细胞因子IL
‑
7，共培养当天记为CTLs诱导培养的第7天；(SSS2)培养第9天，半量换液，补加基础培养基并补加1000IU/ml细胞因子IL
‑
2、2ng/ml的IL
‑
7细胞因子，调整细胞浓度为1
‑2×
106/ml继续培养，置于37℃、5％CO2培养箱中，调整细胞浓度为1
‑2×
106/ml继续培养；(SSS3)培养第11天，半量换液，补加基础培养基并补加1000IU/ml细胞因子IL
‑
2、2ng/ml的细胞因子IL
‑
7，调整细胞浓度为1
‑2×
106/ml继续培养，置于37℃、5％CO2培养箱中，调整细胞浓度为1
‑2×
106/ml继续培养；(SSS4)培养第14天，收获细胞，即得抗HBV的混合免疫细胞制剂。2.根据权利要求1所述的抗HBV的混合免疫细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述DC初始培养基的组成为CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基和10％的血浆。3.根据权利要求1所述的抗HBV的混合免疫细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述DC培养基的组成为CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基、1000IU/ml的GM
‑
CSF和1000IU/ml的IL
‑
4。4.根据权利要求1所述的抗HBV的混合免疫细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述DC诱导成熟培养基为CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基、1000IU/ml的GM
...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢佳琦，
申请(专利权)人：广州先康达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：