一种提高多能干细胞分化成造血干细胞的效率的培养基及方法技术

本发明专利技术公开了一种提高多能干细胞分化成造血干细胞的效率的培养基及方法，包括第一阶段培养基、第二阶段培养基和第三阶段培养基；所述第一阶段培养基包括E8完全培养基、SCF、rhG

【技术实现步骤摘要】
一种提高多能干细胞分化成造血干细胞的效率的培养基及方法


[0001]本专利技术属于生物
，尤其是涉及一种提高多能干细胞分化成造血干细胞的效率的培养基及方法。

技术介绍

[0002]造血干细胞(Hematopoietic Stem Cell,HSC)是一小群具有高度的自我复制和多向分化潜能的最原始的造血细胞。这就是说，造血干细胞具有两个重要的特征：其一，高度的自我更新或自我复制能力；其二，可分化生成所有类型的血细胞。在发生学上，造血干细胞属于成体干细胞的一种。又因其可分化出至少12种血细胞，所以造血干细胞是一种多能的干细胞。
[0003]造血干细胞的应用主要包括造血干细胞移植和作为基因治疗的靶细胞，造血干细胞由于取材容易、易于体外培养、易于植回患者体内并存活以及自我更新能力强等优点，是基因治疗理想的靶细胞之一。将外源基因转入从患者体内采集的造血干细胞，回输给患者后，通过在体内表达而治疗疾病。到目前为止，造血干细胞已经用于腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症、戈谢病(Gaucher desease)、HIV感染及癌症的基因治疗。然而造血干细胞在数量上是一个很大的难题。首先造血干细胞是静止的且很少分裂并且现在胚胎干细胞的来源有限；体细胞克隆的人类胚胎操作过程繁琐，成本太高，且伦理学上未得到人们的普遍认同；体外对干细胞进行诱导、增殖和定向分化，在技术上尚存在一定的困难，无法在体外培养造血干细胞也会延缓和阻碍这一新疗法的发展进程。
[0004]传统方法中多能干细胞分化成造血干细胞的效率低下，并且其诱导分化培养基中通常添加有血清以促进细胞增殖，并将多能干细胞与不同的基质细胞共培养，如OP9细胞等，直接定向诱导分化为造血细胞；然而此传统方法中使用血清增加了污染源，并且使用OP9细胞具有未知风险，安全性低。

技术实现思路

[0005]本专利技术为了克服现有技术的不足，提供一种提高多能干细胞分化成造血干细胞的效率的培养基及方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的培养基，包括第一阶段培养基、第二阶段培养基和第三阶段培养基；
[0007]所述第一阶段培养基包括E8完全培养基、SCF、rhG
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CSF、VEGF、PDGF，所述第一阶段培养基中SCF、rhG
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CSF、VEGF、PDGF的终浓度比为(1.0
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2.0)∶(1.0
‑
2.0)∶(0.25
‑
0.5)∶(1.0
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2.0)；
[0008]所述第二阶段培养基包括E6基础培养基、CHIR99021、VEGF、SCF、IL
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3、CSF，所述第二阶段培养基中CHIR99021、VEGF、SCF、IL
‑
3、CSF的终浓度比为(0.25
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1.0)∶(1.0
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2.0)∶(0.5
‑
2.0)∶(0.5
‑
2.0)∶(0.5
‑
2.0)；
[0009]所述第三阶段培养基包括StemlineⅡ基础培养基、SCF、HGH、Flt3L、EPO、EGF、新型的嘧啶吲哚化合物，所述第三阶段培养基中SCF、HGH、Flt3L、EPO、EGF、新型的嘧啶吲哚化合物的终浓度比为(0.5
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2.0)∶(0.2
‑
0.4)∶(0.5
‑
2.0)∶(0.5
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2.0)∶(1.0
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2.0)∶(0.2
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0.4)。
[0010]可选的，所述新型的嘧啶吲哚化合物包括UM171、UM729的一种或两种。
[0011]可选的，所述第一阶段培养基中SCF的终浓度为50
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100ng/mL、rhG
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CSF的终浓度为50
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100ng/mL、VEGF的终浓度为10
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50mM/mL、PDGF的终浓度为50
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100ng/mL；所述第二阶段培养基中CHIR99021的终浓度为1
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5μM、VEGF的终浓度为50
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100ng/mL、SCF的终浓度为20
‑
80ng/mL、IL
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3的终浓度为20
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80ng/mL、CSF的终浓度为20
‑
80ng/mL；所述第三阶段培养基中SCF的终浓度为20
‑
80ng/mL、HGH的终浓度为10
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100ng/mL、Flt3L的终浓度为20
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80ng/mL、EPO的终浓度为20
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80ng/mL、EGF的终浓度为20
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80ng/mL、新型的嘧啶吲哚化合物的终浓度为10
‑
50μM。
[0012]可选的，所述第一阶段培养基中SCF、rhG
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CSF、VEGF、PDGF的终浓度比为1.0∶1.0∶0.25∶1.0；所述第二阶段培养基中CHIR99021、VEGF、SCF、IL
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3、CSF的终浓度比为0.25∶1.0∶1.0∶0.625∶0.625；所述第三阶段培养基中SCF、HGH、Flt3L、EPO、EGF、新型的嘧啶吲哚化合物的终浓度比为1.0∶0.5∶1.0∶1.0∶2.0∶0.2。
[0013]可选的，所述第一阶段培养基中SCF的终浓度为80ng/mL、rhG
‑
CSF的终浓度为80ng/mL、VEGF的终浓度为20ng/mL、PDGF的终浓度为80ng/mL；所述第二阶段培养基中CHIR99021的终浓度为2μM、VEGF的终浓度为80ng/mL、SCF的终浓度为80ng/mL、IL
‑
3的终浓度为50ng/mL、CSF的终浓度为50ng/mL；所述第三阶段培养基中VEGF的终浓度为40ng/mL、SCF的终浓度为50ng/mL、HGH的终浓度为10ng/mL、Flt3L的终浓度为20ng/mL、EPO的终浓度为40ng/mL、EGF的终浓度为40ng/mL、新型的嘧啶吲哚化合物的终浓度为35μM。
[0014]本专利技术还公开了一种提高多能干细胞分化成造血干细胞的效率的方法，包括以下步骤：
[0015]S1：将多能干细胞置于Aggrewell板中，并于权利要求1
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5任一项所述的第一阶段培养基中进行第一阶段的诱导分化成为拟胚体；
[0016]S2：将拟胚体置于权利要求1
‑
5任一项所述的第二阶段培养基中进行第二阶段的诱导分化；
[0017]S3：将S2诱导分化后的细胞混合物置于权利要求1
‑
5任一项所述的第三阶段培养基中进行第三阶段的诱导分化。
[0018]可选的，将多能本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高多能干细胞分化成造血干细胞的效率的培养基，其特征在于：包括第一阶段培养基、第二阶段培养基和第三阶段培养基；所述第一阶段培养基包括E8完全培养基、SCF、rhG
‑
CSF、VEGF、PDGF，所述第一阶段培养基中SCF、rhG
‑
CSF、VEGF、PDGF的终浓度比为(1.0
‑
2.0)∶(1.0
‑
2.0)∶(0.25
‑
0.5)∶(1.0
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2.0)；所述第二阶段培养基包括E6基础培养基、CHIR99021、VEGF、SCF、IL
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3、CSF，所述第二阶段培养基中CHIR99021、VEGF、SCF、IL
‑
3、CSF的终浓度比为(0.25
‑
1.0)∶(1.0
‑
2.0)∶(0.5
‑
2.0)∶(0.5
‑
2.0)∶(0.5
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2.0)；所述第三阶段培养基包括StemlineⅡ基础培养基、SCF、HGH、Flt3L、EPO、EGF、新型的嘧啶吲哚化合物，所述第三阶段培养基中SCF、HGH、Flt3L、EPO、EGF、新型的嘧啶吲哚化合物的终浓度比为(0.5
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2.0)∶(0.2
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0.4)∶(0.5
‑
2.0)∶(0.5
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2.0)∶(1.0
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2.0)∶(0.2
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0.4)。2.根据权利要求1所述的一种提高多能干细胞分化成造血干细胞的效率的培养基，其特征在于，所述新型的嘧啶吲哚化合物包括UM171、UM729的一种或两种。3.根据权利要求1所述的一种提高多能干细胞分化成造血干细胞的效率的培养基，其特征在于，所述第一阶段培养基中SCF的终浓度为50
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100ng/mL、rhG
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CSF的终浓度为50
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100ng/mL、VEGF的终浓度为10
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50mM/mL、PDGF的终浓度为50
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100ng/mL；所述第二阶段培养基中CHIR99021的终浓度为1
‑
5μM、VEGF的终浓度为50
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100ng/mL、SCF的终浓度为20
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80ng/mL、IL
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3的终浓度为20
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80ng/mL、CSF的终浓度为20
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80ng/mL；所述第三阶段培养基中SCF的终浓度为20
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80ng/mL、HGH的终浓度为10
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100ng/mL、Flt3L的终浓度为20
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80ng/mL、EPO的终浓度为20
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80ng/mL、EGF的终浓度为20
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80ng/mL、新型的嘧啶吲哚化合物的终浓度为10
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【专利技术属性】
技术研发人员：曹哲厚，吴立前，韦俊，马悦悦，王振坤，
申请(专利权)人：杭州原生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：