一种细胞流式分析干细胞细胞因子的方法技术

本发明专利技术公开了一种细胞流式分析干细胞细胞因子的方法，本发明专利技术提供了一种通过合适的培养以及刺激条件，真实的模拟造血干细胞应激造血的体内条件，并通过固定破膜流式分析技术，检测出准确的造血干细胞胞内的细胞因子表达情况的染色技术。本发明专利技术操作较为简便，对细胞悬液制备操作的要求较低，只需要熟练掌握细胞培养的技术并按照本技术设计的条件培养就能获得与体内感染真实情况相符的应激造血的造血干细胞。且不需要制备芯片等操作，成本较低。本发明专利技术通过化合物将会分泌出胞外的细胞因子滞留在细胞内，可以有效准确地测量细胞胞内及胞外的细胞因子表达情况。为进一步地深入探讨造血干前体细胞的细胞因子表达与分泌的调控机制奠定技术基础。机制奠定技术基础。机制奠定技术基础。

【技术实现步骤摘要】
progenitor cell，HSPC)。该方法基于流式分析技术，通过合适的活化刺激剂与培养条件以模拟细胞在体内的真实情况。该方法能够更大程度地在体外检测到细胞胞内的细胞因子的表达情况，为进一步地深入探讨造血前体细胞的细胞因子表达与分泌的调控机制奠定技术基础。
[0009]本专利技术的第一个目的提供一种用于细胞流式分析的活化刺激剂的组合物。
[0010]本专利技术的第二个目的提供一种用于细胞流式分析的活化刺激剂的组合物。
[0011]本专利技术的第二个目的提供一种细胞流式分析干细胞细胞因子的细胞培养方法。
[0012]本专利技术的第三个目的提供一种细胞流式分析干细胞细胞因子的方法。
[0013]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：
[0014]本专利技术通过用两个模型，分别是LPS+Pam3CSK4(脂多糖和三酰酯肽)诱导造血干细胞应激造血的感染模型，以及Hepa1
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6成瘤小鼠模型的脾脏基质细胞上清诱导造血干细胞的应激造血的模型，在特定的培养条件(IMDM+10％FBS)下，加入干细胞生长因子(Stem Cell Factor,SCF)、促血小板生成素(Thrombopoietin,TPO)、Flt3 Ligand蛋白(Flt3L)以维持造血干细胞的活性，并使其在体外扩增。最后通过PMA(豆蔻酰佛波醇乙酯)和ION(离子霉素)的使用，加快蛋白质合成；并通过BFA(布雷菲德菌素a)使细胞因子存储在细胞内。
[0015]由于造血干细胞在体外的培养条件较为苛刻，需要加入细胞因子以维持其活性与功能，因此对于造血干细胞的体外培养条件的摸索是很有必要的。此外，活化刺激剂的组合及浓度对于能否更大程度检测到造血干细胞胞内表达因子的水平也是至关重要的。
[0016]从而专利技术人发现了最合适的培养条件和活化刺激剂的种类及浓度，培养条件为IMDM+10％FBS，细胞因子组合为SCF+TPO+Flt3L，活化刺激剂组合为PMA+ION+BFA或PMA+Monensin，每个刺激的浓度为PMA 25ng/mL、ION 1g/mL、BFA 5g/mL、Monensin 2μM。进而通过BD公司的固定破膜试剂盒，检测造血干细胞胞内细胞因子的表达。
[0017]因此本专利技术要求保护一种用于细胞流式分析的活化刺激剂的组合物，含有PMA、ION和BFA。
[0018]在流式细胞分析技术中使用活化刺激剂诱导细胞活化，进一步刺激细胞分泌细胞因子，从而达到放大但是仍能反应原有细胞分子分泌情况的目的。
[0019]优选地，所述PMA的工作浓度为10～100ng/mL。
[0020]更优选地，所述PMA的工作浓度为25ng/mL。
[0021]优选地，所述ION的工作浓度为1～10μg/mL。
[0022]更优选地，所述ION的工作浓度为1μg/mL。
[0023]优选地，所述BFA的工作浓度为1～50μg/mL。
[0024]更优选地，所述BFA的工作浓度为5μg/mL。
[0025]因此本专利技术要求保护一种用于细胞流式分析的活化刺激剂的组合物，含有PMA和Monensin。
[0026]优选地，所述Monensin的工作浓度为1～20μM。
[0027]更优选地，所述Monensin的工作浓度为2μM。
[0028]优选地，所述PMA的工作浓度为10～100ng/mL。
[0029]更优选地，所述PMA的工作浓度为25ng/mL。
[0030]一种细胞流式分析干细胞细胞因子的细胞培养方法，利用所述的组合物。
[0031]优选地，所述PMA的工作浓度为10～100ng/mL。
[0032]更优选地，所述PMA的工作浓度为25ng/mL。
[0033]优选地，所述ION的工作浓度为1～10μg/mL。
[0034]更优选地，所述ION的工作浓度为1μg/mL。
[0035]优选地，所述BFA的工作浓度为1～50μg/mL。
[0036]更优选地，所述BFA的工作浓度为5μg/mL。
[0037]优选地，所述Monensin的工作浓度为1～20μM。
[0038]更优选地，所述Monensin的工作浓度为2μM。
[0039]优选地，用含有所述组合物的及细胞因子的培养基培养待测干细胞，共培养，所述细胞因子为SCF、TPO和Flt3L。
[0040]更优选地，共培养4～6小时。
[0041]进一步优选地，共培养6小时。
[0042]优选地，所述细胞因子为SCF、TPO和Flt3L的组合。
[0043]更优选地，所述SCF的工作浓度为20～50ng/mL。
[0044]进一步优选地，所述SCF的工作浓度为50ng/mL。
[0045]更优选地，所述TPO的工作浓度为20～50ng/mL。
[0046]进一步优选地，所述TPO的工作浓度为20ng/mL。
[0047]更优选地，所述Flt3L的工作浓度为50～200ng/mL。
[0048]进一步优选地，所述Flt3L的工作浓度为100ng/mL。
[0049]优选地，所述培养基为IMDM+10％FBS。
[0050]本专利技术还要求保护一种细胞流式分析干细胞细胞因子的方法，利用任一所述的细胞培养方法培养待测细胞。
[0051]优选地，与细胞表面抗体反应；洗涤细胞，离心，去上清，打散细胞；进行固定破膜，与细胞内部抗体；进行流式分析。
[0052]通过与细胞表面(胞外)抗体和细胞内部(胞内)抗体进行反应，标记出待测细胞，并对待测分子标记进行标记。
[0053]优选地，所述干细胞为造血干细胞或祖细胞。
[0054]优选地，所述干细胞为小鼠造血干和/或祖细胞：待测细胞为造血干细胞即Lin
low/
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Sca1
+
c
‑
Kit
high
造血干细胞、多潜能干细胞；待测细胞为造血祖细胞即Lin
low/
‑
Sca1
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c
‑
Kit
high
定向祖细胞；
[0055]优选地，所述干细胞为人造血干和/或祖细胞：待测细胞为造血干细胞即Lin
‑
CD34
+
CD38
‑
造血干细胞、多潜能干细胞；待测细胞为造血祖细胞为Lin
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CD34
+
CD38
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定向祖细胞。
[0056]专利技术具有以下有益效果：
[0057]本专利技术提供了一种通过合适的培养以及刺激条件，真实地模拟造血干细胞应激造血的体内条件，并通过固定破膜流式分析技术，检测出准确的造血干细胞胞内的细胞因子表达情况的染色技术。与微流体单细胞蛋白质组学分析相比，本专利技术操作较为简便，对细胞悬液制备操作的要求较低本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于细胞流式分析的活化刺激剂的组合物，其特征在于，含有PMA、ION和BFA。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述PMA的工作浓度为10～100ng/mL；所述ION的工作浓度为1～10μg/mL；所述BFA的工作浓度为1～50μg/mL。3.一种用于细胞流式分析的活化刺激剂的组合物，其特征在于，含有PMA和Monensin。4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述PMA的工作浓度为10～100ng/mL；所述ION的工作浓度为1～10μg/mL。5.一种细胞流式分析干细胞细胞因子的细胞培养方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述的组合物。6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑利民，罗舒凤，吴翀，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：