用于治疗退行性关节炎的自体外周血干细胞的培养方法技术

本发明专利技术提供了用于治疗退行性关节炎的自体外周血干细胞的培养方法，包括以下步骤：步骤一：脂肪组织的处理；步骤二：脂肪间充质干细胞的分离；步骤三：脂肪间充质干细胞的培养；步骤四：脂肪间充质干细胞的提取物的获得；步骤五：自体外周血干细胞的培养。且采用自体脂肪间充质干细胞的提取和培养，进行多代脂肪间充质干细胞培养混合形成的培养基进行自体外周血干细胞的培养，解决外周血造血干细胞来源有限及数目少问题；且在本发明专利技术中优化了整个自体脂肪间充质干细胞的提取方法，使获得干细胞纯度更高，利用Ⅰ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶，提高了消化速度，同时本发明专利技术中利用了血清培养液，避免了潜在的病毒或支原体污染。了潜在的病毒或支原体污染。

【技术实现步骤摘要】
用于治疗退行性关节炎的自体外周血干细胞的培养方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体地，涉及用于治疗退行性关节炎的自体外周血干细胞的培养方法。

技术介绍

[0002]退行性关节炎称骨关节炎、退行性关节炎、老年性关节炎、肥大性关节炎，是一种退行性病变，系由于增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生。根据调查研究的显示，在我国，骨关节患者达到了一亿以上，骨关节患者占我国总人口的近10％之多，而骨关节炎中最为常见的便是膝关节炎，根据相关数据显示，膝关节炎致残率全球第二，且发病率会随着年龄的增长而变高，可见，膝关节炎已经是伴随和困扰现代人的一个常见病。
[0003]随着干细胞研究的不断发展和普及，越来越多的研究者将干细胞技术扩展至骨关节炎治疗之中，通过干细胞治疗，有效的解决上述的这些问题。但是由于外周血造血干细胞在外周血单个核细胞中的比例低，能够采集到的造血干细胞总数十分有限，不能满足临床需求。且异基因外周血造血干细胞移植存在来源不稳定，费用较高。上述两方面都阻碍了干细胞技术用于骨关节炎治疗之中。
[0004]脂肪组织来源的干细胞(Adipose
‑
derived stem cells，ADSCs)是从脂肪组织中分离提取得到的，具有取材容易、对机体损伤小、体内储备量大、体外可大规模培养、多向分化潜能等优点。间充质干细胞(MSC)是成人干细胞的一个子集，起源于中胚层并且存在于几乎所有的成年组织。实验表明，MSC在合适的刺激下分泌的细胞物质可以使MSC适合软骨和骨修复。脂肪来源的MSC具有丰富的MSC数目，很容易从患者自身的自体脂肪组织获取，组织供应充足等特点，可以弥补外周血造血干细胞数目少的问题。
[0005]因此，本专利技术提供了用于治疗退行性关节炎的自体外周血干细胞的培养方法，以自体脂肪来源的间充质干细胞促进外周血造血干细胞培养，解决外周血造血干细胞来源有限及数目少问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供用于治疗退行性关节炎的自体外周血干细胞的培养方法。
[0007]本专利技术要解决的技术问题：外周血造血干细胞来源有限，价格高昂的问题；外周血造血干细胞数目少的问题。
[0008]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现:
[0009]用于治疗退行性关节炎的自体外周血干细胞的培养方法，包括以下步骤：
[0010]步骤一：脂肪组织的处理：局部麻醉下通过脂肪切除或吸脂的方法收集人脂肪组织，置于提前配好的含抗生素及抗真菌药物的无菌生理盐水中，无菌条件下生理盐水强力清洗并剔除可见血管组织和去除大部分血细胞，离心去除多余的水溶液和血液，然后加入磷酸盐缓冲液(PBS)，转移至37℃气浴培养箱中，以100r/min回旋震荡，重复漂洗，每次
30min，用移液管将组织下层的液体吸出，至所吸出的液体清晰为止；
[0011]步骤二：脂肪间充质干细胞的分离：向步骤一获得物中加入等体积的消化液进行消化，放入摇床中，37℃下150r/min旋转消化30
‑
50min后，加入无血清培养液，终止消化，以离心力1000g速度在室温下离心15分钟，静置3
‑
5min，此时液面分为三层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含多种细胞层，弃去上层以及中间层，然后以PBS缓冲溶液洗涤，再以300g离心力离心5min，移除上层清液，重复三次，去除PBS溶液；
[0012]步骤三：脂肪间充质干细胞的培养：将无血清培养液吹打步骤二获得的下层细胞，然后进行接种培养，24h后更换新鲜的培养液，弃去非贴壁细胞，以后每24小时更换培养液一次，待细胞生长达到80％融合，按1:3的比例进行传代,在此过程分多次分别收集多代的无血清培养液和传代干细胞；
[0013]步骤四：脂肪间充质干细胞的提取物的获得：将步骤三获得的多代的无血清培养液进行混合，得合并无血清培养液，再将各传代干细胞混合，离心收集干细胞上清液，并和合并无血清培养液混合，过滤，取上清滤液，获得脂肪间充质干细胞的提取物；
[0014]步骤五：自体外周血干细胞的培养：将步骤四获得脂肪间充质干细胞的提取物与无血清培养液混合，作为培养基进行自体外周血干细胞的培养。
[0015]进一步地，所述无血清培养液是以β
‑
巯基乙醇为溶剂，溶质为L
‑
谷氨酰胺、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、表皮生长因子和谷胱甘肽配置而成的，其中，L
‑
谷氨酰胺、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、表皮生长因子和谷胱甘肽的浓度分别为1
‑
5mmol/L、15
‑
25ng/Ml、5
‑
25ng/ml、5
‑
25ng/ml、5
‑
25μg/ml。
[0016]进一步地，步骤二中，消化液为质量终浓度为0.2
‑
0.3％的混合胶原酶液，其中混合胶原酶由Ⅰ型胶原酶和Ⅳ型胶原酶按照质量比为1:0.8
‑
1.5的比例混合而成。
[0017]进一步地，步骤三中，接种密度为2.5
‑
3.2
×
104/cm2，培养环境：温度为37℃、CO2浓度为5
‑
10％、湿度为90
‑
95％。
[0018]进一步地，步骤三中，多代的无血清培养液为P3
‑
P20代脂肪间充质干细胞中的至少任意两代的无血清培养液，传代干细胞为P3
‑
P20代脂肪间充质干细胞中的至少任意两代的传代干细胞。
[0019]进一步地，步骤四中，离心力为400
‑
900g。
[0020]进一步地，步骤四中，过滤为使用0.22
‑
0.25μm的微孔滤膜过滤。
[0021]进一步地，步骤五中，脂肪间充质干细胞的提取物与无血清培养液质量的加入比为1:1
‑
1.5。
[0022]本专利技术的有益效果：
[0023]本专利技术采用自体脂肪间充质干细胞的提取和培养，进行多代脂肪间充质干细胞培养混合形成的培养基进行自体外周血干细胞的培养，解决外周血造血干细胞来源有限及数目少问题；且在本专利技术中优化了整个自体脂肪间充质干细胞的提取方法，使获得干细胞纯度更高，利用Ⅰ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶，不仅提高了消化速度，而且能够消化掉大多数的组织块，使得不溶性组织块大幅减少，而且本专利技术中未使用机械操作，不会影响干细胞活性，同时本专利技术中对培养液进行了重新配置，不含动物血清，避免了潜在的病毒或支原体污染。
具体实施方式
[0024]对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于治疗退行性关节炎的自体外周血干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：脂肪组织的处理：局部麻醉下通过脂肪切除或吸脂的方法收集人脂肪组织，置于提前配好的含抗生素及抗真菌药物的无菌生理盐水中，无菌条件下生理盐水强力清洗并剔除可见血管组织和去除大部分血细胞，离心去除多余的水溶液和血液，然后加入PBS缓冲液，转移至37℃气浴培养箱中，以100r/min回旋震荡，重复漂洗，每次30min，用移液管将组织下层的液体吸出，至所吸出的液体清晰为止；步骤二：脂肪间充质干细胞的分离：向步骤一获得物中加入等体积的消化液进行消化，放入摇床中，37℃下150r/min旋转消化30
‑
50min后，加入无血清培养液，终止消化，以离心力1000g速度在室温下离心15分钟，静置3
‑
5min，此时液面分为三层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含多种细胞层，弃去上层以及中间层，然后以PBS缓冲溶液洗涤，再以300g离心力离心5min，移除上层清液，重复三次，去除PBS溶液；步骤三：脂肪间充质干细胞的培养：将无血清培养液吹打步骤二获得的下层细胞，然后进行接种培养，24h后更换新鲜的培养液，弃去非贴壁细胞，以后每24小时更换培养液一次，待细胞生长达到80％融合，按1:3的比例进行传代,在此过程分多次分别收集多代的无血清培养液和传代干细胞；步骤四：脂肪间充质干细胞的提取物的获得：将步骤三获得的多代的无血清培养液进行混合，得合并无血清培养液，再将各传代干细胞混合，离心收集干细胞上清液，并和合并无血清培养液混合，过滤，取上清滤液，获得脂肪间充质干细胞的提取物；步骤五：自体外周血干细胞的培养：将步骤四获得脂肪间充质干细胞的提取物与无血清培养液混合，作为培养基进行自体外周血干细胞的培养。2.根据权利要求1所述的用于治疗退行性关节炎的自体外周血干细胞的培养方法，其特征在于，所述培养液是以β
‑
巯基乙醇为溶剂，溶质为L
‑
谷氨酰胺、碱性成纤维细胞生长因子、...

【专利技术属性】
技术研发人员：占震锋，李庆静，
申请(专利权)人：上海南滨江细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：