一种从诱导多能干细胞分化CD4制造技术

本发明专利技术涉及免疫学技术领域，具体涉及一种从诱导多能干细胞分化CD4

【技术实现步骤摘要】
一种从诱导多能干细胞分化CD4
+
非T细胞的方法


[0001]本专利技术涉及免疫学
，具体涉及一种从诱导多能干细胞分化CD4
+
非T细胞的方法。

技术介绍

[0002]细胞治疗在现如今的临床治疗中正在发挥着越来越重要的作用，其显著的效果已经展现了细胞治疗在各种疾病治疗尤其是肿瘤治疗方面不可磨灭的作用，其中运用最广泛的就是免疫细胞，随着CAR
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T，NK，DC疫苗等技术不断地发展和成熟，解决免疫细胞的数量少和批次间差异等问题刻不容缓。
[0003]人的iPSC细胞是一种具有多向分化潜能且能无限增殖的细胞，它是通过向人原代体细胞中转入OCT4、SOX2、c
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Myc、Klf4基因，然后通过该基因表达的蛋白一系列的转录调控作用将细胞重编程为具有多潜能性的细胞，iPSC能够在特定的培养基和多种细胞因子组合培养下分化成CD34+造血祖细胞，该细胞是多种免疫细胞的前体细胞，能够再进一步分化成多种免疫细胞，因此iPSC来源的免疫细胞可以很好地为细胞治疗提供源源不断的原料，因此本专利技术提供一种从诱导多能干细胞分化CD4
+
非T细胞的方法。

技术实现思路

[0004]针对现有技术所存在的上述缺点，本专利技术的第一目的在于提供一种从诱导多能干细胞分化CD4
+
非T细胞的方法，解决上述
技术介绍
中的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：
[0006]一种从诱导多能干细胞分化CD4
+
非T细胞的方法，具体包括以下步骤：
[0007]S1、PSC细胞维持培养：iPSC用商品化的E8培养基进行维持培养，E8培养基含有L－抗坏血酸，转铁蛋白，胰岛素，FGF2，TGFβ1等因子，能够很好的维持iPSC的全能性，iPSC培养在含有Matrigel的6孔板中；
[0008]S2、制作EB(拟胚体)：拟胚体是胚胎干细胞或者iPSC细胞在体外一定条件下自发形成的球状细胞聚集体，具有分化和胚胎类似的外胚层，中胚层和内胚层的能力，从EB出发分化目的细胞更快，纯度更高；
[0009]S3、分化EB至中胚层：将AggreWell
TM
800培养板中的EB球重悬起来，吸入15ml离心管中，静置3min，小心弃去上清，用1ml EB分化培养基Ⅰ重悬(EB分化培养基Ⅰ采用stemlineⅡ培养基加上20
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50ng/mL hBMP
‑
4,10
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30ng/mL hbFGF和20
‑
50ng/mL VEGF不仅能够很好的维持EB结构，还可使EB定向分化至中胚层，中胚层是各类免疫细胞来源的造血干细胞的发源地)，重悬后将EB球转移至超低吸附的6孔板中，用EB分化培养基Ⅰ分化两天；
[0010]S4、分化中胚层至CD34
+
的造血祖细胞：在上述步骤两天后用Matrigel胶包被6孔板，每孔加入2ml F12培养基15ul Matrigel胶混匀，放入37℃，CO2培养箱中包被1h，包被完成后弃去F12培养基，每孔加入2ml EB分化培养基Ⅱ，将超低吸附板中的EB球收集起来，弃去上清，转移至上述培养板和培养基中，每孔40个EB球，该培养体系下培养14天，每隔3天换
一次新的EB分化培养基Ⅱ；
[0011]S5、分化CD34
+
的造血祖细胞至CD4
+
非T免疫细胞：将上述培养体系的培养基弃去，余下细胞采用EB分化培养基Ⅲ继续分化，每隔两天换新的EB分化培养基Ⅲ，分化8天后，流式检测细胞CD45 CD56 CD3 CD8 CD4的表达情况。
[0012]优选的，所述步骤S1每次分化前确保iPSC稳定传了2代以上。
[0013]优选的，所述步骤S2中，使用AggreWell
TM
800培养板制作EB，具体方法如下：将6孔板培养细胞密度达到90％的ESC细胞弃去培养基，加入1ml D
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PBS清洗一遍，弃去D
‑
PBS，向洗过后的细胞培养孔中加入1mlTryple，放入37℃，CO2培养箱中消化4分钟，消化完毕后显微镜下观察细胞有明显要脱落痕迹后，向培养孔中加入3ml D
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PBS中和消化液，利用移液枪和枪头将未脱落的细胞轻轻吹洗下来，转入15ml离心管中，400g离心3min；
[0014]离心后弃上清并用1mlE8培养基重悬，取含40
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80万个细胞的细胞悬液，加入AggreWell
TM
800培养板中，加入E8培养基补至2ml，再加入4ul iROCK，用移液枪混匀(注意不要产生气泡)，混匀后封口膜封板，400g离心30s，离心后撕去封口膜，将AggreWell
TM
800板放入37℃，CO2培养箱中培养1天。
[0015]优选的，所述步骤S3是在步骤S2中AggreWell
TM
800培养板培养一天后进行。
[0016]优选的，所述步骤S4中EB分化培养基Ⅱ具体为：采用stemlineⅡ培养基加上10
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30ng/mL hSCF,10
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30ng/mL hFlt3L and 20
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40ng/mL TPO，该细胞因子及其浓度的组合加上stemlineⅡ培养基能够将中胚层细胞分化为CD34
+
CD43
+
的造血祖细胞。
[0017]优选的，所述步骤S5中EB分化培养基Ⅲ为：采用stemlineⅡ培养基加上10
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30ng/mL IL
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15，10
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30ng/mL hSCF，10
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30ng/mL hFlt3L该细胞因子及其浓度的组合加上stemlineⅡ培养基能够将CD34
+
CD43
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的造血祖细胞定向分化为CD4
+
非T免疫细胞。
[0018]有益效果
[0019]采用本专利技术提供的技术方案，与已知的公有技术相比，具有如下有益效果：
[0020]本专利技术将人血液细胞来源的iPSC在特定培养基中和不同细胞因子组合培养下，分化为CD4
+
非T免疫细胞，人体中表达CD4
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的非T免疫细胞主要包括BDCA4
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树突状细胞(DC)、CD33
+
Myeloid细胞和CD14
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的单核细胞有着十分重要的免疫调节作用，BDCA4
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DC细胞是属于Plasmacytoid DC(pDC)的一种亚型，pDC是从共同淋巴样祖细胞分化而来的DC细胞，与共同髓样祖细胞来源的cDC相比，pDC有较弱的抗原呈递能力，但是pDC表达的TLR7和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从诱导多能干细胞分化CD4
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非T细胞的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：S1、PSC细胞维持培养：iPSC用商品化的E8培养基进行维持培养，E8培养基含有L－抗坏血酸，转铁蛋白，胰岛素，FGF2，TGFβ1等因子，能够很好的维持iPSC的全能性，iPSC培养在Matrigel包被的6孔板中；S2、制作EB(拟胚体)：拟胚体是胚胎干细胞或者iPSC细胞在体外一定条件下自发形成的球状细胞聚集体，具有分化和胚胎类似的外胚层，中胚层和内胚层的能力，从EB出发分化目的细胞更快，纯度更高；S3、分化EB至中胚层：将AggreWell
TM
800培养板中的EB球重悬起来，吸入15ml离心管中，静置3min，小心弃去上清，用1ml EB分化培养基Ⅰ重悬(EB分化培养基Ⅰ采用stemlineⅡ培养基加上20
‑
50ng/mL hBMP
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4,10
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30ng/mL hbFGF和20
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50ng/mL VEGF不仅能够很好的维持EB结构，还可使EB定向分化至中胚层，中胚层是各类免疫细胞来源的造血干细胞的发源地)，重悬后将EB球转移至超低吸附的6孔板中，用EB分化培养基Ⅰ分化两天；S4、分化中胚层至CD34
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的造血祖细胞：在上述步骤两天后用Matrigel胶包被6孔板，每孔加入2ml F12培养基15ul Matrigel胶混匀，放入37℃，CO2培养箱中包被1h，包被完成后弃去F12培养基，每孔加入2ml EB分化培养基Ⅱ，将超低吸附板中的EB球收集起来，弃去上清，转移至上述培养板和培养基中，每孔40个EB球，该培养体系下培养14天，每隔3天换一次新的EB分化培养基Ⅱ；S5、分化CD34
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的造血祖细胞至CD4
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非T免疫细胞：将上述培养体系的培养基弃去，余下细胞采用EB分化培养基Ⅲ继续分化，每隔两天换新的EB分化培养基Ⅲ，分化8天后，流式检测细胞CD45 CD56CD3 CD8 CD4的表达情况。2.根据权利要求1所述的一种从诱导多能干细胞分化CD4
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非T细胞的方法，其特征在于：所述步骤S1每次分化前确保iPSC稳定传了2代以上。3.根据权利要求1所述的一种从诱导多能干细胞分化CD4
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非T细胞的方法，其特征在于：所述步骤S2中，使用AggreWell
TM
800培养板制作EB，具体方法如...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦俊，季伟，王振坤，曹哲厚，
申请(专利权)人：杭州原生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：