一种低成本多能干细胞分化造血干细胞的培养基及培养方法技术

本发明专利技术涉及一种低成本多能干细胞分化造血干细胞的培养基，包括第一阶段培养基和第二阶段培养基；所述第一阶段培养基包括DMEM/F12基础培养基、SCF、rhG

【技术实现步骤摘要】
一种低成本多能干细胞分化造血干细胞的培养基及培养方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种低成本多能干细胞分化造血干细胞的培养基及培养方法。

技术介绍

[0002]造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)是一类多能干细胞,位于特殊的造血微环境,主要存在于骨髓中。能自我更新和多向分化为各种功能的血细胞,维持血液系统的建立和动态平衡。造血干细胞的这些重要特性以及造血干细胞移植在临床上的广泛应用,结合基因治疗和基因编辑技术的进步,使得基于造血干细胞治疗多种血液疾病和免疫疾病的基因治疗研究在近年来取得了很大的进展。
[0003]许多血液学家提出CD34细胞在人体的有效输注量为>5
×
10/kg，一些脐带血移植的权威们建议脐带血有核细胞的有效剂量为>3.7
×
10/其中CD34细胞含量按0 6％计算有22
×
10/kg。上述脐带血有核细胞和CD34细胞的有效剂量都是从临床实践中总结出来的。因此，获得大剂量的CD34细胞是必要的，而目前比较有效的培养基大都价格昂贵，大大提高了获得CD34细胞的成本，对于研究用或病患用都是一个很大的问题。
[0004]现有的干细胞培养基，价格高昂，导致了干细胞的培养成本较高；并且传统方法中的人多能干细胞诱导分化培养基中通常将多能干细胞与不同的基质细胞共同培养，如OP9细胞等，直接定向诱导分化为造血细胞；然而方法中使用OP9细胞具有未知风险，安全性低

技术实现思路

[0005]本专利技术为了克服现有技术的不足，提供一种低成本多能干细胞分化造血干细胞的培养基及培养方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种低成本多能干细胞分化造血干细胞的培养基，包括第一阶段培养基和第二阶段培养基；
[0007]所述第一阶段培养基包括DMEM/F12基础培养基、SCF、rhG
‑
CSF、VEGF、PDGF、FGF2、NODAL、亚硒酸钠、L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸酯镁盐、AB血清；所述第一阶段培养基中所述的SCF、rhG
‑
CSF、VEGF、PDGF、FGF2、NODAL的终浓度比为(1
‑
2)∶(1
‑
2)∶(0.5
‑
1)∶(1
‑
2)∶(1
‑
4)∶(1
‑
4)；
[0008]所述第二阶段培养基包括RPMI
‑
1640基础培养基、CHIR99021、VEGF、SCF、IL
‑
3、CSF、TGFβ1、Flt3L、EPO、胰岛素以及AB血清；所述第二阶段培养基中所述的CHIR99021、VEGF、SCF、IL
‑
3、CSF、TGFβ1、Flt3L、EPO的终浓度比为(0.25
‑
1)∶(1
‑
2)∶(0.4
‑
1.6)∶(0.4
‑
1.6)∶(0.4
‑
1.6)∶(0.01
‑
0.1)∶(0.4
‑
1.6)∶(0.4
‑
1.6)。
[0009]可选的，所述的第一阶段培养基中SCF的终浓度为50
‑
100ng/mL、rhG
‑
CSF的终浓度为50
‑
100ng/mL、VEGF的终浓度为10
‑
50mM/mL、PDGF的终浓度为50
‑
100ng/mL、FGF2的终浓度为50
‑
200ng/mL、NODAL的终浓度为50
‑
200ng/mL、亚硒酸钠的终浓度为10
‑
100ug/mL、L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸酯镁盐的终浓度为50
‑
200ng/mL、AB血清的体积分数为10％；所述的第二阶段
培养基中CHIR99021的终浓度为1
‑
5uM/mL、VEGF的终浓度为50
‑
100ng/mL、SCF的终浓度为20
‑
80ng/mL、IL
‑
3的终浓度为20
‑
80ng/mL、CSF的终浓度为20
‑
80ng/mL、TGFβ1的终浓度为0.5
‑
5ng/mL、Flt3L的终浓度为20
‑
80ng/mL、EPO的终浓度为20
‑
80ng/mL、胰岛素的终浓度为10
‑
50ug/mL、AB血清的体积分数为10％。
[0010]可选的，所述第一阶段培养基中，所述的SCF、rhG
‑
CSF、VEGF、PDGF、FGF2、NODAL的终浓度比为1∶1∶0.5∶1∶2∶2；所述第二阶段培养基中，所述的CHIR99021、VEGF、SCF、IL
‑
3、CSF、TGFβ1、Flt3L、EPO的终浓度比为0.04∶1.6∶1∶1∶1∶0.04∶1∶1。
[0011]可选的，所述第一阶段的培养基中SCF的终浓度为80ng/mL、rhG
‑
CSF的终浓度为80ng/mL、VEGF的终浓度为80ng/mL、PDGF的终浓度为80ng/mL、FGF2的终浓度为100ng/mL、NODAL的终浓度为100ng/mL、亚硒酸钠的终浓度为20ug/mL、L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸酯镁盐的终浓度为100ng/mL；所述第二阶段培养基中，CHIR99021的终浓度为2uM/mL、VEGF的终浓度为80ng/mL、SCF的终浓度为50ng/mL、IL
‑
3的终浓度为50ng/mL、CSF的终浓度为50ng/mL、TGFβ1的终浓度为2ng/mL、FLt3L的终浓度为50ng/mL、EPO的终浓度为50ng/mL、胰岛素的终浓度为20ug/mL、AB血清的终浓度为10％。
[0012]本专利技术还公开了一种低成本多能干细胞分化造血干细胞的方法，包括以下步骤：S1：将多能干细胞置于Aggrewell板中，并于权利要求1
‑
4任一项所述的第一阶段培养基中进行第一阶段的诱导分化成为拟胚体；
[0013]S2：将拟胚体置于权利要求1
‑
4任一项所述的第二阶段培养基中进行第二阶段的诱导分化。
[0014]可选的，将多能干细胞接种于Aggrewell板进行拟胚体分化的第一阶段培养记为第0天，所述第一阶段的诱导分化自第0天开始至第4天结束，所述第二阶段的诱导分化自第4天开始至第12天结束。
[0015]可选的，所述第一阶段的诱导分化的第0天至第4天，接种时期使用第一阶段分化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种低成本多能干细胞分化造血干细胞的培养基，其特征在于，包括第一阶段培养基和第二阶段培养基；所述第一阶段培养基包括DMEM/F12基础培养基、SCF、rhG
‑
CSF、VEGF、PDGF、FGF2、NODAL、亚硒酸钠、L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸酯镁盐、AB血清；所述第一阶段培养基中所述的SCF、rhG
‑
CSF、VEGF、PDGF、FGF2、NODAL的终浓度比为(1
‑
2)∶(1
‑
2)∶(0.5
‑
1)∶(1
‑
2)∶(1
‑
4)∶(1
‑
4)；所述第二阶段培养基包括RPMI
‑
1640基础培养基、CHIR99021、VEGF、SCF、IL
‑
3、CSF、TGFβ1、Flt3L、EPO、胰岛素以及AB血清；所述第二阶段培养基中所述的CHIR99021、VEGF、SCF、IL
‑
3、CSF、TGFβ1、Flt3L、EPO的终浓度比为(0.25
‑
1)∶(1
‑
2)∶(0.4
‑
1.6)∶(0.4
‑
1.6)∶(0.4
‑
1.6)∶(0.01
‑
0.1)∶(0.4
‑
1.6)∶(0.4
‑
1.6)。2.根据权利要求1所述的低成本多能干细胞分化造血干细胞的培养基，其特征在于，所述的第一阶段培养基中SCF的终浓度为50
‑
100ng/mL、rhG
‑
CSF的终浓度为50
‑
100ng/mL、VEGF的终浓度为10
‑
50ng/ml、PDGF的终浓度为50
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100ng/mL、FGF2的终浓度为50
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200ng/mL、NODAL的终浓度为50
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200ng/mL、亚硒酸钠的终浓度为10
‑
100ug/mL、L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸酯镁盐的终浓度为50
‑
200ng/mL、AB血清的体积分数为10％；所述的第二阶段培养基中CHIR99021的终浓度为1
‑
5uM、VEGF的终浓度为50
‑
100ng/mL、SCF的终浓度为20
‑
80ng/mL、IL
‑
3的终浓度为20
‑
80ng/mL、CSF的终浓度为20
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80ng/mL、TGFβ1的终浓度为0.5
‑
5ng/mL、Flt3L的终浓度为20

【专利技术属性】
技术研发人员：曹哲厚，韦俊，吴立前，马悦悦，
申请(专利权)人：杭州原生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：