一种诱导多能干细胞向造血前体细胞分化的培养基以及方法技术

本发明专利技术涉及一种诱导多能干细胞向造血前体细胞分化的培养基以及方法。具体的，所述方法包括1)从人多能干细胞分化产生生血内皮前体细胞的方法，制备获得生血内皮前体细胞；2)以促进生血内皮前体细胞向造血前体细胞分化的方法，制备造血前体细胞。在制备过程中采用本发明专利技术的培养基并采用随机旋转的方式培养，获得了优异的有效效率，且培养基成分明确。且培养基成分明确。且培养基成分明确。

【技术实现步骤摘要】
一种诱导多能干细胞向造血前体细胞分化的培养基以及方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种诱导多能干细胞向造血前体细胞分化的方法。

技术介绍

[0002]多能性干细胞，包括胚胎来源的胚胎干细胞和体外重编程诱导来源的诱导型多能干细胞。多能性干细胞能够在体外具有长期培养保持自我更新能力，并且具有多向分化的潜能，包括分化为几乎所有功能性的血液细胞。造血前体细胞是具有自我更新能力并能分化为各种血细胞的前体细胞，最终生成各种血细胞成分，包括红细胞、白细胞和血小板，它们也可以分化成各种其他细胞。在临床中，造血干/祖细胞以及各种成熟的血液细胞可服务于临床上的造血干细胞移植和血细胞输注治疗的重大战略需求。而如何获得足够多的造血干细胞一直以来是困扰研究人员和医务人员的难题。自2001年，Kaufman等首次实现将人胚胎干细胞分化为CD34+的造血干/祖细胞后[Kaufman D,Hanson E,Lewis et al.Hematopoietic colony
‑
forming cells derived from human embryonic stem cells.Proc Natl Acad USA.2001；98(19):10716
‑
21]，人们相继开展了人类多能干细胞体外分化为造血干细胞及相关的研究。虽然在这个领域已经有了一定的进展，从目前临床应用的角度来看，人多能干细胞体外造血分化的研究仍然面临着非常大挑战，例如人多能干细胞诱导分化而来的生血内皮前体细胞和造血干细胞和功能细胞数量不足以满足一次输入的需求；人多能干细胞诱导的分化而来的造血干细胞不具备体内移植的能力；体外培养的条件包含了血清、饲养层细胞等外源性物质，这些问题会大大的限制了目前采用人多能干细胞体外造血分化的临床应用。
[0003]由于目前的这些方法培养条件较为复杂，分化周期相对较长，分化效率和产量较低，可操作性较差。基于以上现有分化技术中存在的问题，亟需寻找一种诱导血管/生血内皮前体细胞生成造血前体细胞的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种操作简单、高效的多能干细胞向造血前体诱导分化体系，其包括多能干细胞向生血内皮前体诱导分化体系，以及生血内皮前体细胞向造血前体细胞诱导分化体系。具体地，本专利技术提供了一种化学成分明确的多能干细胞向造血前体细胞分化的培养基，以及使用该培养基探索了一种利用随机回转仪模拟微重力效应来高效诱导多能干细胞向人造血前体细胞分化的方法；该方法与现有方法相比，具有较高的可操作性与可重复性，为将来大规模生产造血前体细胞用于生物医学和临床治疗奠定技术基础。
[0005]第一方面，本专利技术提供一种中胚层细胞诱导分化培养基，其包括基础分化培养基和骨形成蛋白4(BMP4)、活化素A(Activin A)以及GSK
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3α/β抑制剂(CHIR99021)；
[0006]所述基础分化培养基为IF9S完全培养基，包括按1:0.8
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1.2的体积比混合的IMDM培养基和F12培养基，以及终浓度为8
‑
12mg/L的聚乙烯醇(PVA)、体积百分比为所述培养基
的0.08
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0.12％的Lipids 100X添加剂、体积百分比为所述IF9S完全培养基的1.8％
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2.2％的ITS
‑
X100X添加剂、终浓度为35
‑
45μl/L的一硫代甘油(αMTG)、终浓度为55
‑
70mg/L的抗坏血酸磷酸酯钠(AA2P)、体积百分比为所述IF9S完全培养基的0.8％
‑
1.2％的谷丙氨酸二肽(GlutaMax
TM
)100X添加剂以及体积百分比为所述IF9S完全培养基的0.8％
‑
1.2％的非必需氨基酸添加剂100X(NEAA)。
[0007]优选地，所述IF9S完全培养基，包括按1:1的体积比混合的IMDM培养基和F12培养基，以及终浓度为10mg/L的聚乙烯醇(PVA)、体积百分比为所述培养基的0.1％的Lipids 100X添加剂、体积百分比为所述IF9S完全培养基的2％的ITS
‑
X 100X添加剂、终浓度为40μl/L的一硫代甘油(αMTG)、终浓度为64mg/L的抗坏血酸磷酸酯钠(AA2P)、体积百分比为所述IF9S完全培养基的1％的GlutaMax
TM 100X添加剂以及体积百分比为所述IF9S完全培养基的1％的非必需氨基酸添加剂100X(NEAA)。
[0008]优选地，所述中胚层细胞分化培养基为IF9S完全培养基添加40
‑
60ng/mL的BMP4，15
‑
25μg/mL的Activin A，0.8
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1.2μM CHIR99021。
[0009]更优选地，所述中胚层细胞分化培养基为IF9S完全培养基添加50ng/mL的BMP4，20μg/mL的Activin A，1μM CHIR99021。
[0010]第二方面，本专利技术提供了一种生血内皮前体细胞诱导分化培养基，其包括基础分化培养基、SB431542、VEGF、bFGF和SCF；
[0011]所述基础分化培养基为IF9S完全培养基，包括按1:0.8
‑
1.2的体积比混合的IMDM培养基和F12培养基，以及终浓度为8
‑
12mg/L的聚乙烯醇(PVA)、体积百分比为所述培养基的0.08
‑
0.12％的Lipids 100X添加剂、体积百分比为所述IF9S完全培养基的1.8％
‑
2.2％的ITS
‑
X100X添加剂、终浓度为35
‑
45μl/L的一硫代甘油(αMTG)、终浓度为55
‑
70mg/L的抗坏血酸磷酸酯钠(AA2P)、体积百分比为所述IF9S完全培养基的0.8％
‑
1.2％的GlutaMax
TM 100X添加剂以及体积百分比为所述IF9S完全培养基的0.8％
‑
1.2％的非必需氨基酸添加剂100X(NEAA)。
[0012]优选地，所述IF9S完全培养基，包括按1:1的体积比混合的IMDM培养基和F12培养基，以及终浓度为10mg/L的聚乙烯醇(PVA)、体积百分比为所述培养基的0.1％的Lipids 100X添加剂、体积百分比为所述IF9S完全培养基的2％的ITS
‑
X 100X添加剂、终浓度为40μl/L的一硫代甘油(αMTG)、终浓度为64mg/L的抗坏血酸磷酸酯钠(AA2P)、体积百分比为所述IF9S完全培养基的1％的GlutaMax
TM 100X添加剂以及体积百分比为所述IF9S完全培养基的1％的非必需氨基酸添加剂100X(NEAA)。
[0013]优选地，所述生血内皮前体分化培养基为IF本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种中胚层细胞诱导分化培养基，其特征在于，其包括基础分化培养基和骨形成蛋白4(BMP4)、活化素A(Activin A)以及GSK
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3α/β抑制剂(CHIR99021)；所述基础分化培养基为IF9S完全培养基，包括按1:0.8
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1.2的体积比混合的IMDM培养基和F12培养基，以及终浓度为8
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12mg/L的聚乙烯醇(PVA)、体积百分比为所述培养基的0.08
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0.12％的Lipids 100X添加剂、体积百分比为所述IF9S完全培养基的1.8％
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2.2％的ITS
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X 100X添加剂、终浓度为35
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45μl/L的一硫代甘油(αMTG)、终浓度为55
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70mg/L的抗坏血酸磷酸酯钠(AA2P)、体积百分比为所述IF9S完全培养基的0.8％
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1.2％的谷丙氨酸二肽(GlutaMax
TM
)100X添加剂以及体积百分比为所述IF9S完全培养基的0.8％
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1.2％的非必需氨基酸添加剂100X(NEAA)；优选地，所述中胚层细胞分化培养基为IF9S完全培养基添加40
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60ng/mL的BMP4，15
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25μg/mL的Activin A，0.8
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1.2μM CHIR99021。2.一种生血内皮前体细胞诱导分化培养基，其特征在于，其包括基础分化培养基、SB431542、VEGF、bFGF和SCF；所述基础分化培养基为IF9S完全培养基，包括按1:0.8
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1.2的体积比混合的IMDM培养基和F12培养基，以及终浓度为8
‑
12mg/L的聚乙烯醇(PVA)、体积百分比为所述培养基的0.08
‑
0.12％的Lipids 100X添加剂、体积百分比为所述IF9S完全培养基的1.8％
‑
2.2％的ITS
‑
X 100X添加剂、终浓度为35
‑
45μl/L的一硫代甘油(αMTG)、终浓度为55
‑
70mg/L的抗坏血酸磷酸酯钠(AA2P)、体积百分比为所述IF9S完全培养基的0.8％
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1.2％的GlutaMax
TM 100X添加剂以及体积百分比为所述IF9S完全培养基的0.8％
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1.2％的非必需氨基酸添加剂100X(NEAA)；优选地，所述生血内皮前体分化培养基为IF9S完全培养基添加8
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12μM SB431542、40
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60ng/mL的VEGF、40
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60ng/mL的bFGF和40
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60ng/mL的SCF。3.一种诱导生血内皮前体细胞向造血前体细胞分化的培养基，其特征在于，其包括基础分化培养基和血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、干细胞因子(SCF)、白介素3(IL
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3)、白介素6(IL
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6)以及血小板生成素(TPO)；所述基础分化培养基为IF9S完全培养基，包括按1:0.8
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1.2的体积比混合的IMDM基础培养基和F12基础培养基，以及终浓度为:8
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12mg/L的聚乙烯醇(PVA)、体积百分比为所述培养基的0.08
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0.12％的Lipids(100X)添加剂、体积百分比为所述培养基的1.8％
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2.2％的ITS
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X(100X)添加剂、终浓度为35
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45μl/L的一硫代甘油(αMTG)、终浓度为55

【专利技术属性】
技术研发人员：雷晓华，张键，马驰原，赵华山，汪宝蓓，李梦霞，李荣荣，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：