调节离子通道活性的药物的鉴定和功能表征的方法技术

提供促进钾离子通道的调质（特别是ＨＥＲＧ通道）的鉴定和表征的材料、方法和计算机系统。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】此申请要求2004年11月16日提交的美国临时申请60/636,494的优先权，其全部内容在此引入作为参考。专利
本专利技术涉及药理学和合理的药物设计的领域。更特别地，该专利技术提供了鉴定调节离子通道活性的药物的方法，如此表征的药物的数据库及进一步评估潜在的治疗化合物的计算机软件程序，其包括常见结构和/或生物物理学的特征。一方面，评估这样的化合物对于特定离子通道尤其HERG钾通道的有害影响。专利技术背景引用的多种公开物和专利文献遍及说明书，以描述本专利技术所属的现有技术的状态。这些引文各自在此以全文并入作为参考。HERG(人ether-a-go-go-related)基因编码作为K+-通道起作用的膜蛋白。这个通道参与心脏组织的复极化。复极化的延迟是与心律失常和心脏病发作相关。穿过HERG通道的钾流量的抑制，是与QT间期(长的QT；EKG记录的部分)的延长相关，即延迟的复极化。这些延迟与心动过缓和心律失常相关。具有不同的化学结构的治疗剂是与LQT相关和/或怀疑引起对HERG蛋白质的不利作用。这些不同类型的药物的实例包括下列：非镇静的抗组织胺类(阿司咪唑，特非那定)、大环内酯类抗生素类(红霉素)、喹诺酮抗生素类(司帕沙星)、抗精神病药类(氟哌啶醇、氯氮平、匹莫齐特、促动力药(西沙必利)、抗心律不齐药类(多非利特)、非钾阳离子通道阻滞剂(维拉帕米、奎尼丁)、β-肾上腺素能阻滞剂类(索他洛尔)、抗真菌药类(酮康唑)、抗疟药类(甲氟喹、氯氟菲醇)及生物胺转运抑制剂(丙米嗪、可卡因)。来自蝎子(东半球和西半球)的天然肽毒素(ergtoxin、Bekm-1)最近已被鉴定为HERG的有效和特定的抑制剂。这里还报道，cAMP通过在环核苷酸结合区域相互作用，改变了HERG活性(63)。-->示例性的具有可论证的不利HERG作用的药用剂包括，例如，多非利特西沙必利特非那定和阿司咪唑由于同HERG相互作用相关的不利副作用，这些药剂从市场除去。单独的西沙必利报道是造成的某些80心脏病发作和>300的住院治疗的原因(www.propulsid-eresource，com/what.cfm)。所述的先前的除去，证明了市场上的药物或研发流水线上的候选药物正在花费企业十亿的税收，数百百万的研究、研发和法律成本。从上述中清楚的是，对HERG具有不利作用的药物可能造成严重的损害或死亡。因此，FDA期望近期的释放指导方针需要测量HERG数据，调查研究新药的顺从性。为了避免这样的有害的作用并消除安全顾虑，药物生产商需要耐用和易于实施的检测方法，以评估这种的候选药物并从开发流水线上清除。专利技术概述根据本专利技术，提供了鉴定调节钾通道活性的试验化合物的硅内筛选方法。示例性的方法要求汇编已知调节钾通道活性的药物的数据集，该数据集含有该药物的生物物理学和结构的特征，其包括观察到的该药物对于钾通道活性的生物学效应；提供了描述上述的结构特征与钾通道的相互作用的系列的算法；而且使用本文的算法估计有或没有这些结构特征的试验化合物，借此鉴定同也调节钾通道的该药物共享结构特征的试验化合物。本专利技术还包括的是通过前述方法鉴定的试验化合物。在特定优选的实施方案中，钾通道是HERG蛋白质通道，进行方法以鉴定表现出与HERG蛋白质的有害的相互作用的试验化合物。本专利技术方法的另一个方面，要求HERG表达细胞与在最初的硅内筛选方法中鉴定的任何试验化合物接触，并确定试验化合物对于HERG通道功能的作用，如比较i)不表达HERG的细胞；ii)没有接触该试验化合物的HERG表达细胞；和iii)接触已知调节HERG的药物的HERG表达细胞。该方法可进一步包括可探测地标记在在初期的硅内筛选方法中鉴定任何试验化合物，在体外进行结合测定以确定用于HERG蛋白质的化合物的结合亲和力及结合位点。一旦功能性的表征，-->使用前述方法获得的任何数据可以包含在已知与钾通道(例如，HERG通道)相互作用的药物的数据集中，用在上述的硅内筛选法中。而在本专利技术的另一个方面，提供了实现上述方法的计算机系统。计算机系统包括与钾通道相互作用的已知药物的生物物理学和结构特征的第一个数据集，包括但不限于表4中列出的钾通道。在一个优选的实施方案中，将鉴定与HERG通道相互作用的药物。计算机系统可以进一步包含第二数据库，其包括至少一个选自三维结构的数据库、序列突变数据库、失败药物数据库、天然产物数据库及化学登记数据库的数据库。在本专利技术的计算机系统中还包括的是含有至少一种完成所述硅内筛选方法的算法的程序。最后，鉴定了HERG蛋白质上的新结合位点，其在此指的是E-4031位点。因此，本专利技术的另一个方面包括基于细胞的功能测定，用以鉴定怀疑通过与E4031位点相互作用而调节HERG蛋白质活性的试验化合物。一个这样的方法包括，使HERG表达细胞与试验化合物接触，并确定试验化合物对于HERG通道功能的作用，如比较i)不表达HERG的细胞；ii)没有接触该试验化合物的HERG表达细胞；和iii)暴露于E4031的细胞。还提供了体外测定确定对于HERG蛋白质或其片段上E-4031位点的试验化合物的结合亲和力。在本专利技术的进一步方面，公开了在E4031位点进行筛选方法的试剂盒。示例性的试剂盒包含HERG表达细胞、非-HERG表达细胞；适于在所有细胞中进行功能测定的试剂；且任选地，试剂适于在体外进行结合测定。附图简述图1.a)HERG-转染细胞证明[3H]-阿司咪唑的剂量依赖的特异性结合。B)HERG-CHO膜煮沸使蛋白质变性，借此降低了特异性结合。图2.随着时间[3H]-阿司咪唑与HERG蛋白质的缔合，如在CHO膜上表达的。Ymax＝最大DPM结合。K＝缔合常数；半衰期是获得1/2总平衡结合的时间(分钟)。图3.用多种化合物抑制[3H]-阿司咪唑结合HERG-CHO膜。图4.结合HERG-CHO膜的[3H]-阿司咪唑的饱和度。非特异性-->结合定义为在10μM特非那定存在下剩余。图5.阿司咪唑剂量依赖阻断HERG K+通道。使用这样的技术，可以跟着Rb+的流出进入上清夜。使用铷，因为其通过HERG K+通道流动，也未以可检测的量存在于常规的介质/水中。图6.Rb+从HERG-转染的CHO细胞向外流出的时间过程，使用原子吸收来检测通道功能。还证明了对于阿司咪唑的敏感性。图7.从训练库(training library)选择的化合物的剂量响应在原子吸附(AA)功能测定法中试验。包括完全、部分和无活性的抑制剂。图8.在[3H]-阿司咪唑结合测定、膜潜在的染色和AA功能测定中筛选26化合物的结果。在10μM下一式两份试验化合物，除了BeKm-I和Ergtoxin(0.1μM)，及阿司咪唑(1μM)。大多数的这些化合物据报道在膜片箝测定中是抑制HERG钾通道，代表不同的治疗和化学分类。某些化合物(E-4031(800％)、特非那定(200％)及匹莫齐特、舍吲哚、氯非铵(1000％)表现出显而易见的抑制，比荧光染料测定中的对照大得多。图9.各个预测与试验性的抑制的比较，通过化合物(10μM)进行。在此扫描图象上，结合测定的准确度是显而易见的。图10.在各个三次测定中，实验性与预测的抑制(10μM)的回归曲线图。图11.这个图包括了硅内筛选中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定调节钾通道活性的试验化合物的方法，所述方法包括：　ａ）汇编已知是调节钾通道活性的药物的数据集，其中该数据集包括该药物的生物物理学和结构的特征，包括观察的该药物对于钾通道活性的生物效应；　ｂ）提供一系列算法，描述该结构特征和该钾通道的相互作用；　ｃ）使用ｂ）的算法评估试验化合物存在或不存在ａ）的结构特征，借此鉴定共享也调节钾通道活性的所述药物的结构特征的试验化合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2004-12-16 60/636,4941.一种鉴定调节钾通道活性的试验化合物的方法，所述方法包括：a)汇编已知是调节钾通道活性的药物的数据集，其中该数据集包括该药物的生物物理学和结构的特征，包括观察的该药物对于钾通道活性的生物效应；b)提供一系列算法，描述该结构特征和该钾通道的相互作用；c)使用b)的算法评估试验化合物存在或不存在a)的结构特征，借此鉴定共享也调节钾通道活性的所述药物的结构特征的试验化合物。2.通过权利要求1的方法鉴定的试验化合物。3.权利要求1的方法，其中该钾通道是选自表4提供的通道。4.权利要求1的方法，其中该药物是选自表5中所列出的药物。5.权利要求1的方法，其中该钾通道是HERG蛋白质通道。6.权利要求5的方法，其中该药物的生物物理学和结构的特征是选自分子量、对HERG的结合亲和力、该药物的化学描述符、溶解度、疏水性、亲水性、一级蛋白质结构、二级蛋白质结构、三级蛋白质结构及HERG表达水平上的改变的至少之一。7.权利要求5的方法，其中该生物效应是选自钾流量的调节、膜去极化、HERG蛋白质相互作用的缺失、HERG通道阻断、激动活性、拮抗活性的至少之一。8.权利要求5的方法，所述方法包括使HERG表达细胞与步骤c)中鉴定的化合物接触，并且确定试验化合物对于HERG通道功能的作用，对比i)不表达HERG的细胞；ii)没有接触该试验化合物的HERG表达细胞，和iii)接触了已知是调节HERG的药物的HERG表达细胞。9.权利要求8的方法，其中使用Rb+外向通量测定、膜电位染料测定、原子吸附功能测定及结合可探测地标记的放射性配体的整个细胞膜评估HERG功能。10.权利要求5的方法，所述方法包括可探测地标记步骤c)中鉴定的化合物，在体外进行结合测定以确定该化合物对于该HERG蛋白质的结合亲和力。11.权利要求1的方法，所述方法进一步包括把由对步骤c)中鉴定的试验化合物进行功能测定而得的数据加入步骤a)的数据集。12.权利要求1的方法，所述方法进一步包括把由对步骤c)中鉴定的试验化合物进行体外结合测定而得的数据加入步骤a)的数据集。13.权利要求8的方法，其中该HERG表达细胞是中国仓鼠的卵巢细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：S佩尔施克，M刘，
申请(专利权)人：新星筛生物科技公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]