一种重组鱼精蛋白专用编码基因和制备方法技术

本发明专利技术提供一种鱼精蛋白专用编码基因和制备方法：利用细胞珠蛋白突变体(CYGBm)和人工合成的Pro基因，采用同尾酶BamHI、BglII将该编码基因不断连接，使Pro基因最终长度为初始长度8倍，构建编码基因载体pET22b

【技术实现步骤摘要】
一种重组鱼精蛋白专用编码基因和制备方法


[0001]本专利技术涉及生物基因工程领域，具体涉及一种重组鱼精蛋白专用编码基因及其利用该编码基因制备重组鱼精蛋白的方法。

技术介绍

[0002]成熟雄鱼的精巢组织称鱼精，因具有异味，多被废弃或作废料。鱼精中含有鱼精蛋白 (Protamine,Pro)，鱼精蛋白也称精蛋白，氨基酸组成的种类和数量不同因鱼种类不同而不同，是一种由30
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50个氨基酸组成的多聚阳离子肽，以精氨酸为主，存在各类雄鱼成熟精巢组织与带负电的DNA紧密结合。自1937年McClean等报道了鱼精蛋白能够抑制伤寒埃氏杆菌的生长、Miller等发现鱼精蛋白能够抑制多种好氧菌和厌氧菌的呼吸代谢从而影响其成长繁殖之后，鱼精蛋白的抑菌作用才受到人们的广泛关注。鱼精蛋白有较好的抑菌作用，对黄色葡萄球菌、酵母菌、霉菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、四链球菌均表现为抑制效果，现在普遍认为鱼精蛋白抑菌活性是由其分子中存在着大量精氨酸，精氨酸中的正电荷胍基与细胞壁肽聚糖的负电荷产生静电作用，尽管鱼精蛋白的长度、蛋白肽和二级结构不同，但它们均能与细胞膜特异性结合，使细胞膜形成通道或者大孔径，导致细胞内化合物外流。鱼精蛋白通过破坏细胞膜结构，破坏能量代谢相关的电子传递系统和物质转运系统，从而导致整个细胞不能正常运行。作为化学防腐剂的替代品逐渐出现在食品添加剂行列。鱼精蛋白作为绿色防腐剂用于食品行业，由于高蛋白食品在传统的储藏运输过程中，温度的波动容易造成反复冻融，滋生大量微生物导致腐败变质，对其质地和口感影响较大。鱼精蛋白具有较好的保鲜作用，为高蛋白产品保鲜上的应用提供新技术。鱼精蛋白作为肝素唯一拮抗剂，在体外循环手术中能较好的使肝素失去抗凝血作用，在没有肝素的抗凝血特性情况下特别有效。

技术实现思路

[0003]本专利技术的主要目的，在于提供一种重组鱼精蛋白专用编码基因CYGBm
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8Pro，该编码基因的碱基序列如SEQ ID NO：9所示。
[0004]本专利技术的另一目的，在于提供一种重组鱼精蛋白专用编码基因制备重组鱼精蛋白的方法，包括如下步骤：
[0005](1)采用重叠PCR方法将细胞珠蛋白CYGB突变获得细胞珠蛋白突变体CYGBm；
[0006](2)利用细胞珠蛋白突变体CYGBm和人工合成的鱼精蛋白Pro基因，采用同尾酶BamHI、 BglII不断连接，使最终鱼精蛋白编码基因长度为初始长度7
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9倍，与载体pET22b连接后热激转化入BL21感受态，获得工程菌BL21
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pET22b
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CYGBm
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8Pro；
[0007](3)挑取经验证正确的工程菌BL21
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pET22b
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CYGBm
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8Pro，筛选高表达量菌株；
[0008](4)挑取(3)筛选出的高表达量菌株于培养基培养，收集菌体；
[0009](5)将步骤(4)收集到的菌体依次采用包涵体裂解液、洗涤液和溶解液处理，得到含有目的蛋白的溶解液；
CYGBm
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8Pro进行CNBr裂解，具体地：将纯化后的融合蛋白CYGBm
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8Pro，置于通风橱中，并于通风橱中加入浓度为0.2M的浓盐酸终、终浓度为50mg/ml的CNBr，避光室温裂解24h，之后加入等体积的ddH2O灭活CNBr；然后采用流速为3mL/min的G
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25分子筛进行脱盐纯化，即得所述重组鱼精蛋白，且脱盐纯化采用的平衡液和洗脱液均为去离子水。
[0018]6.根据权利要求一种编码基因制备鱼精蛋白的方法，其特征在于：所述LB培养基：10g/LTryptone,5g/L Yeast Extarct,10g/L NaCl；乳糖培养基：12g/L Tryptone,15g/L Yeast Extarct,3g/L KH2PO4,7g/L K2HPO4,2.5g/L NaCl,2g/L葡糖糖，0.7g/L乳糖，0.27g/L MgSO4。
[0019]本专利技术的有益效果在于：细胞珠蛋白(Cytoglobin，CYGB)是珠蛋白家族中新的一员， 2001年因其和肝星状细胞一起协同作用而被发现，2002年将其命名为细胞珠蛋白。因CYGB 蛋白在大肠杆菌中表达量极大，本专利技术借助CYGB蛋白来实现目的蛋白的高效表达。本专利技术将CYGB内部的甲硫氨酸对应的密码子ATG全部突变为异亮氨酸对应的密码子ATC(起始密码子除外)获得CYGBm；后续纯化过程中再用CNBr切割CYGB
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鱼精蛋白中的甲硫氨酸位点，以裂解出鱼精蛋白。同时，为增加鱼精蛋白的拷贝数，利用同尾酶BamHI、BglII不断连接，使最终鱼精蛋白编码基因长度为初始长度7
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9倍(优选为8倍)，构建了CYGBm
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8Pro专用编码基因。因此，本专利技术提供了一种鱼精蛋白专用编码基因并揭露了利用该编码基因制备融合鱼精蛋白的方法，且该编码基因能够有效的制备所得融合鱼精蛋白，经CNBr裂解易于实现重组鱼精蛋白的大量制备，且所获得的重组鱼精蛋白具有抑菌效果。
附图说明
[0020]下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。
[0021]图1是本专利技术中重叠延伸PCR定点突变CYGB流程图
[0022]图2是本专利技术中pET22b
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CYGBm
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8Pro质粒的构建流程图
[0023]图3是本专利技术中G
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25葡聚糖柱分离纯化
[0024]图4是本专利技术中肝素琼脂糖凝胶柱分离纯化
[0025]图5是本专利技术中CM阳离子琼脂糖凝胶柱分离纯化
[0026]图6是本专利技术中不同浓度重组鱼精蛋白的抑菌活性
[0027]图7是本专利技术中重组鱼精蛋白处理虾储存期间pH值变化曲线图
[0028]图8为本专利技术中重组鱼精蛋白处理虾储存期间TVB
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N值变化曲线图。
具体实施方式
[0029]下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。以下各实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、酶切等都采用常规的方法。实施例1鱼精蛋白专用编码基因的构建
[0030]1.1 pET22b
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CYGBm质粒的构建(构建过程如图1所示)
[0031]将CYGB内部的甲硫氨酸对应的密码子ATG全部突变为异亮氨酸对应的密码子ATC(起始密码子除外)获得CYGBm。设计引物：根据CYGB的序列以及要突变的位点，设计了8条引物，引物序列如下：
[0032]SEQ ID NO.1:5
’‑
AACATATGGAGAAAGTGCCAGGCGAG
‑3’
[0033]SEQ ID NO.2:5
’‑
GGCCCAGATAGCCTGCACCGCCTT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
Tris
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HCl，pH8.0、1M NaCl
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20mM Tris
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HCl，pH8.0、1.5M NaCl
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20mM Tris
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HCl，pH8.0，缓冲液依次洗脱；将含目的蛋白接收液再经CM阳离子琼脂糖凝胶层析柱分离纯化，50mM NaCl
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20mM Tris
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HCl，pH8.0、0.2M NaCl
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20mM Tris
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HCl，pH8.0、0.5M NaCl
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20mM Tris
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HCl，pH8.0、1M NaCl
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20mM Tris
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HCl，pH8.0、1.5M NaCl
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20mM Tris
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HCl，pH8.0缓冲液依次洗脱，将最终含有目的蛋白CYGBm
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8Pro洗脱液经超滤管脱盐。8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(5)所述菌体裂解液为：1.22g Tris
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HCl、5.85g NaCl、0.075g EDTA、3.3mL 30％曲拉通X100，加入150mL超纯水溶解，调pH至8.0，定容至200mL；0.22μm滤膜过滤，4℃保存；包涵体洗涤液为：称取3.1g Tris
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HCl、14.63g NaCl、0.186g EDTA、8.3mL 30％曲拉通X100、60.2g尿素，加入400mL超纯水溶解，调pH至8.0，定容至500mL；0.22μm滤膜过滤，4℃保存；包涵体溶解液为：称取3.1g Tris
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...

【专利技术属性】
技术研发人员：李招发，邱丹丹，
申请(专利权)人：华侨大学，
类型：发明
国别省市：