一种乌鳢源金属硫蛋白基因、检测引物、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种乌鳢源金属硫蛋白基因、检测引物、试剂盒及检测方法，核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。本发明专利技术具有简便快速、特异性好、灵敏度高的特点，而且可用于研究分析乌鳢中重金属含量与金属硫蛋白之间的关系，有利于养殖中水产品重金属含量的诊断与预防。中水产品重金属含量的诊断与预防。中水产品重金属含量的诊断与预防。

【技术实现步骤摘要】
一种乌鳢源金属硫蛋白基因、检测引物、试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及水生动物质量安全检测
，特别涉及一种乌鳢源金属硫蛋白基因、检测引物、试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]乌鳢（Ophiocephalus argus）属鲈形目攀鲈亚目醴科醴属，俗称黑鱼、乌鱼等，属肉食性鱼类，是目前我国淡水池塘养殖的主要鱼类品种之一。作为一种底栖鱼类，乌鳢处于水生食物链的上层，易通过呼吸、体表接触及摄食等方式富集环境中的重金属，研究发现其体内重金属含量显著高于其他养殖品种，可能存在一定的食用安全风险。因此，了解评估重金属对乌鳢等水生生动物的毒性效应并探求对其有效的解毒机制就显得尤为重要。
[0003]金属硫蛋白（Metallothioneins，MT）是一类分子质量为6
‑
7kDa，富含半胱氨酸（约含30%）的可诱导的多功能蛋白。MT在生物体内对缓解重金属的毒性，参与微量元素的储存、运输，以及增强机体免疫与应激能力、清除自由基等方面担负着重要的生理功能。其中金属可诱导性是MT参与重金属解毒的基础，其丰富的巯基（
‑
SH）可强力螯合有毒重金属离子并将其排出体外从而终止对机体的毒害，且MT对Hg、Cd、Cu、Zn均具有解毒能力。金属亲和分析法、电化学法、免疫法、色谱法等是目前较为成熟的金属硫蛋白检测技术，然而上述技术在实际检测工作中，存在以下问题：一是精密度、检出限不能满足要求；二是操作繁琐、费时；三是仪器设备昂贵，基层难以推广；四是放射性同位素的使用可能会影响操作人员的身体健康。
[0004]研究显示，MT在转录水平上易被环境中的重金属所诱导，且这种诱导与重金属浓度具有相关性，金属硫蛋白作为监测水环境重金属污染的一个重要标志物，已经得到广泛关注随着分子生物学等新兴技术手段在环境领域的应用。因此可以通过实时荧光定量PCR技术检测MT，从而指示环境中重金属污染物水平。特异性引物该技术的关键，目前已经筛选到多种鱼类的MT特异性引物,这为水生动物的重金属毒性效应及解毒机制研究提供了技术支撑。但是乌鳢的金属硫蛋白基因，特异性检测引物均未报道过，亟需建立基于乌鳢金属硫蛋白的评估体系。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种乌鳢源金属硫蛋白基因、检测引物、试剂盒及检测方法，引物具有特异性强、重复性好的特点，可用于定性定量分析乌鳢源MT基因的表达量，进而评估乌鳢体内重金属的含量。
[0006]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种乌鳢源金属硫蛋白基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。专利技术人经过长期探索研究，发现了金属硫蛋白编码基因，并对其进行测序和报道，该基因属于功能性基因，可用于评估乌鳢体内重金属含量。
[0007]本专利技术采用随机扩增筛选技术获得乌鳢MT基因片段，依据所获得基因序列完成乌
鳢MT基因特异性引物的设计和筛选，在此基础上利用实时荧光定量PCR技术分析乌鳢不同组织中MT的表达水平。本专利技术设计的引物具有良好的特异性和重复性，利用上述引物进行实时荧光定量PCR法检测乌鳢源MT操作简便、耗时少（仅一个多小时）、特异性高、易于判断等优点， MT基因的表达量直接反应了MT在乌鳢体内的含量，而MT含量与乌鳢体内重金属含量呈正相关，这样就能为快速准确定量乌鳢体内重金属含量的研究提供新的途径。
[0008]一种用于检测乌鳢源金属硫蛋白基因的引物，所述引物包括：正向引物W1MT
‑
F：5
’‑
GGATGTGATGAATCTAATCTGCC
‑3’
，反向引物W1MT
‑
R：5
’‑
GCTTTAAATAAGTTTGTTTGTGCTG
‑3’
。
[0009]该引物具有特异性强，重复性好的特点，可用于定性定量分析乌鳢源MT基因的表达量，进而评估乌鳢体内重金属的含量，该方法克服现有检测方法在水产动物质量安全监测中无法直接应用的问题，适合乌鳢中金属硫蛋白检测，对于重金属在鱼体内的沉积量可以定量评估。
[0010]一种用于检测乌鳢源金属硫蛋白基因的试剂盒，包括扩增体系，所述扩增体系包括10
×
PCR buffer、2.5mM的dNTP、5 U/μl rTaq酶及10μM的引物。
[0011]25μl扩增体系组成为：10
×
PCR buffer 2.5μl，2.5mM的dNTP2μL，5 U/μl rTaq酶 0.25μl，10μM的引物各0.25μL，模板DNA 1
‑
3μL，灭菌双蒸水补至25μL。
[0012]所述引物包括：正向引物W1MT
‑
F：5
’‑
GGATGTGATGAATCTAATCTGCC
‑3’
，反向引物W1MT
‑
R：5
’‑
GCTTTAAATAAGTTTGTTTGTGCTG
‑3’
。
[0013]一种乌鳢源金属硫蛋白基因的定量检测方法，包括如下步骤：（1）DNA提取：取25～50mg的鱼肌肉或肝脏，加入50～100μL组织裂解液匀浆混合，56℃温育30～60min，95℃变性5min，8000rpm 离心1min，取离心上清液作为模板DNA；（2）荧光定量PCR：反应体系如下：10μL SYBR，10μM 引物各1μl，1
×
ROX 0.2μl，模板DNA 1μl，用无菌水补至20μl；（3）结果判断：仪器自动收集荧光信号，并自动制作熔解曲线，计算
△
CT值，在Excel中产生柱状图，分析乌鳢中金属硫蛋白基因的表达量。
[0014]扩增条件为：94℃预变性1min , 94℃ 20s, 58℃ 30s, 72℃ 15s, 进行40个循环。
[0015]本专利技术的有益效果是：采用本专利技术的试剂盒和检测方法首次用于检测乌鳢金属硫蛋白基因，同时检测过程所需时间短、特异性强、灵敏度高。本专利技术避免了无法采用分子方法来分析评估乌鳢组织中的重金属含量，常规测量乌鳢组织中的重金属高低，方法存在操作繁琐、耗时长等缺点。因此，本专利技术所涉及的利用乌鳢组织中的金属硫蛋白基因表达量来评估乌鳢养殖过程中受到有害重金属污染情况，具有较好的独创性和实用性。同时，本专利技术检测靶点具有单一特异性，检测结果特异，易于判定。
附图说明
[0016]图1为PCR方法扩增乌鳢金属硫蛋白基因的特异性试验。M：DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；泳道1：草鱼；泳道2：鲢鱼；泳道3：青鱼；泳道4：鲫鱼；泳道5：对虾；泳道6：罗氏沼虾；泳道7
‑
12：乌鳢。
[0017]图2为养殖周期中乌鳢肝脏组织中金属硫蛋白基因荧光定量实验结果图。
[0018]图3为养殖周期中乌鳢肝脏组织中重金属汞的含量。
具体实施方式
[0019]下面通过具体实施例，对本专利技术的技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乌鳢源金属硫蛋白基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。2.一种用于检测乌鳢源金属硫蛋白基因的引物，其特征在于，所述引物包括：正向引物W1MT
‑
F：5
’‑
GGATGTGATGAATCTAATCTGCC
‑3’
，反向引物W1MT
‑
R：5
’‑
GCTTTAAATAAGTTTGTTTGTGCTG
‑3’
。3.一种用于检测乌鳢源金属硫蛋白基因的试剂盒，其特征在于，包括扩增体系，所述扩增体系包括10
×
PCR buffer、2.5mM的dNTP、5 U/μl rTaq酶及10μM的引物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，25μl扩增体系组成为：10
×
PCR buffer 2.5μl，2.5mM的dNTP 2μL，5 U/μl rTaq酶 0.25μl，10μM的引物各0.25μL，模板DNA 1
‑
3μL，灭菌双蒸水补至25μL。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物包括：正向引物W1MT
‑
F：5
’‑
GGATGTGATGAATCTAATCTGCC
‑3’
，反向引物W1MT
‑
R：5...

【专利技术属性】
技术研发人员：施沁璇，林锋，郝贵杰，周冬仁，孙博弈，盛鹏程，徐磊，吴琦芳，
申请(专利权)人：浙江省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：