CRISPR系统及其在构建STXBP1突变的癫痫性脑病克隆猪核供体细胞中的应用技术方案

本发明专利技术公开了CRISPR系统及其在构建STXBP1突变的癫痫性脑病克隆猪核供体细胞中的应用。一种用于猪STXBP1基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含序列如SEQ ID NO.2所示的Cas9高效表达载体pKG

【技术实现步骤摘要】
CRISPR系统及其在构建STXBP1突变的癫痫性脑病克隆猪核供体细胞中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及用于STXBP1基因编辑的CRISPR/Cas9系统及其应用。

技术介绍

[0002]癫痫(Epilepsy)即俗称的“羊角风”或“羊癫风”，是大脑神经元突发性异常放电导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病。由于异常放电的起始部位和传递方式的不同，癫痫发作的临床表现复杂多样，可表现为发作性运动、感觉、自主神经、意识及精神障碍等症状。癫痫患者经过正规的抗癫痫药物治疗，约70％的患者其发作是可以得到控制的，其中50％～60％的患者经2～5年的治疗可以痊愈，患者可以和正常人一样地工作和生活。癫痫的发病机制非常复杂，中枢神经系统兴奋与抑制间的不平衡导致癫痫发作，其主要与离子通道神经递质及神经胶质细胞的改变有关。
[0003]癫痫性脑病(Epileptic encephalopathies，EEs)是癫痫性异常导致进展性脑部功能障碍，是一种儿童期常见的脑部疾病，以多种严重的癫痫症候群为特征的神经系统功能紊乱性疾病。EEs是发生在婴儿和儿童的严重痉挛性疾病，首次发病多见儿童、青年时期，男性高于女性，儿童死亡率是成人的10倍，然而病因、发病机制仍不十分明确，年龄依赖性是EEs的共同特征，早发性癫痫性脑病(Early
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onset epileptic encephalopathies，EOEE)包括早发性肌阵挛脑病(Early myoclonic epileptic encephalopathy，EMEE)、大田原综合征(Ohtahara syndrome，OS)、婴儿恶性游走性部分性癫痫(Malignant migrating partial seizures in infancy，MMPSI)、West综合征、Lennox
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Gastaut(LGS)综合征及Dravet综合征等。
[0004]大田原综合征是由日本学者大田原(Ohtahara)于1977年首次报道，是一种早期婴儿型癫痫性脑病，伴抑制
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爆发波型脑电图改变，是年龄依赖性癫痫性脑病的一种，其主要特点为3个月以内特别是新生儿期发病，频繁的成串或单次强直痉挛发作，多数在清醒和睡眠中均可见到。患儿多有非对称性先天性脑结构异常，治疗困难，发作难以控制，据国外文献报导，约1/3的患儿在两岁内死亡，存活到学龄期的患儿多伴有严重的精神、运动发育障碍，预后极差。
[0005]突触融合蛋白结合蛋白1(STXBP1，也称为MUNC18
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1)是突触前神经递质释放机制的重要组成部分，由STXBP1基因编码，在神经元中表达，调节神经元钙通道敏感性，负责突触间神经递质的释放，促进突触囊泡的沉淀与膜融合，参与突触囊泡循环。在人类中，STXBP1杂合突变导致了几种最严重的癫痫性脑病，包括大田原综合征、West综合征、Lennox
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Gastaut综合征、Dravet综合征以及其他类型的早发性癫痫性脑病。此外，STXBP1是散发性智力障碍和发育障碍中最常见的突变基因之一。所有STXBP1脑病患者均表现出智力残疾，大部分为中度至重度，并且95％的患者患有癫痫病。超过90％的患者患有运动障碍，例如肌张力障碍，痉挛，共济失调，肌张力低下和震颤。已有研究结果显示STXBP1脑病主要
是由单倍体不足引起的，超过60％的报道突变是缺失、无意义突变、移码或剪接位点变异，错义变体使蛋白质不稳定并引起聚集以进一步减少野生型(WT)蛋白质水平。因此，本专利技术基于STXBP1基因突变开发了克隆猪核移植供体细胞，后期通过体细胞核移植动物克隆技术培育出活体猪模型，体内STXBP1的部分功能丧失将为模拟STXBP1脑病和研究其发病机理提供研究工具，并为相关药物的开发及临床应用提供有效的实验数据，也为成功治疗人类相关疾病奠定基础。
[0006]基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供猪STXBP1基因的gRNA及其表达载体。
[0008]本专利技术的另一目的是提供一种用于猪STXBP1基因编辑的CRISPR/Cas9系统及其应用。
[0009]本专利技术的又一目的是提供一种重组细胞。
[0010]本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：
[0011]猪STXBP1基因的gRNA靶点，其特征在于序列如SEQ ID NO.17所示。
[0012]猪STXBP1基因的gRNA，其特征在于序列如SEQ ID NO.35所示。
[0013]一种针对猪STXBP1基因的gRNA表达载体，该表达载体表达SEQ ID NO.35所述的gRNA。
[0014]作为本专利技术的一种优选，该表达载体的载体骨架为pKG
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U6gRNA，质粒全序列如SEQ ID NO.3所示。
[0015]作为本专利技术的进一步优选，所述的gRNA表达载体是将SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的单链DNA退火得到的具有粘性末端的双链DNA分子插入载体骨架pKG
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U6gRNA的BbsI限制性内切酶位点所得。
[0016]一种用于猪STXBP1基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含本专利技术所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体；所述的Cas9表达载体为pU6gRNA
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eEF1a
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mNLS
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hSpCas9
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EGFP
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PURO，该质粒全序列如SEQ ID NO.2所示。
[0017]为了增加Cas9质粒的基因编辑能力，申请人在购自addgene(Plasmid#42230，from Zhang Feng lab)pX330
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U6
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Chimeric_BB
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CBh
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hSpCas9(简称PX330)载体的基础上进行改造得到pU6gRNA
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eEF1a
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mNLS
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hSpCas9
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EGFP
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PURO(简称质粒pKG
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GE3)。PX330的图谱如图1，改造方式如下：
[0018]1)去除原载体gRNA骨架中多余无效的序列；
[0019]2)改造启动子：将原有启动子(chickenβ
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.猪STXBP1基因的gRNA靶点，其特征在于序列如SEQ ID NO.17所示。2.猪STXBP1基因的gRNA，其特征在于序列如SEQ ID NO.35所示。3.一种针对猪STXBP1基因的gRNA表达载体，其特征在于该表达载体表达权利要求2所述的gRNA。4.根据权利要求3所述的gRNA表达载体，其特征在于该表达载体的载体骨架为pKG
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U6gRNA，质粒全序列如SEQ ID NO.3所示。5.根据权利要求4所述的gRNA表达载体，其特征在于所述的gRNA表达载体是将SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的单链DNA退火得到的具有粘性末端的双链DNA分子插入载体骨架pKG
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U6gRNA的BbsI限制性内切酶位点所得。6.一种用于猪STXBP1基因编辑的CRISPR/Cas9系统，其特征在于包含权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛冬，汪滔，陶裴裴，曾为俊，王磊，程锐，赵泽英，马翔，黄彩云，
申请(专利权)人：南京启真基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：