一种乐伐替尼耐药基因DUSP9、其筛选方法及应用技术

本发明专利技术涉及肿瘤耐药基因技术领域，特别涉及一种乐伐替尼耐药基因DUSP9、其筛选方法及应用，DUSP9的基因的序列为SEQ ID NO：1。其筛选方法包括以下步骤：进行预实验，获得sgRNA文库的最佳MOI，确定乐伐替尼的浓度；进行感染Cas9文库实验，得到稳定株；稳定株加入乐伐替尼处理，通过PCR扩增和高通量测序，分析sgRNA的富集情况；筛选乐伐替尼耐药基因；有效靶基因对肝癌细胞功能表型及介导乐伐替尼耐药的作用验证。本发明专利技术通过CRISPR/Cas9全基因文库筛选得到乐伐替尼的耐药基因，为今后减少乐伐替尼耐药性提供了理论依据，为乐伐替尼的临床应用提供了新的耐药靶点，为临床合理用药提供指导。指导。指导。

【技术实现步骤摘要】
一种乐伐替尼耐药基因DUSP9、其筛选方法及应用


[0001]本专利技术涉及肿瘤耐药基因
，特别涉及一种乐伐替尼耐药基因DUSP9、其筛选方法及应用。

技术介绍

[0002]肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在我国所有中位居第三死亡率高居第二位死亡率高居第二位死亡率高居第二位。2018年9月4日乐伐替尼在中国上市，用于晚期肝癌的一线治疗在中国上市，用于晚期肝癌的一线治疗在中国上市，用于晚期肝癌的一线治疗，乐伐替尼正式取代索拉非尼成为国际上晚期肝癌一线治疗的首选药物，是小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂，主要作用于是小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂，乐伐替尼主要作用于是小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂，同时具有抗肿瘤细胞增殖及抗血管生成作用，靶向药物耐药的主要机制包括肿瘤建立代偿信号通路、靶蛋白改变、肿瘤微环境变化、肿瘤异质性产生和肿瘤对靶向药物的适应等，不同的分子靶向药物可能同时具有多种耐药机制，毫无疑问，分子靶向治疗为肿瘤患者提供了生存和预后获益，但耐药也是分子靶向药物面临的主要问题。目前对于乐伐替尼长期使用后产生的耐药性，尚未见报道，因此，积极探索乐伐替尼的耐药靶基因，对于减少乐伐替尼耐药，指导临床用药有着重要意义。
[0003]以往，药物耐药基因常用RNAi文库进行高通量筛选。但RNAi技术造成的表型变化不够稳定、明显，且细胞内源性的RNAi途径导致RNAi筛选存在着广泛的脱靶效应。CRISPR/Cas9 作为一种强大的基因组编辑工具，可以对基因进行完全敲除，为高通量筛选带来了革命性技术。在此基础上构建靶向全基因组范围的CRISPR/Cas9敲除文库，可实现全基因组范围的高通量筛选，能够快速产生功能缺失的突变体并且筛选所期望的表型，进而找出候选基因。与 RNAi技术相比，CRISPR/Cas9敲除文库具有相对较低的脱靶效率和更广泛的作用位点，因而逐渐成为功能性基因筛选的热点方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种乐伐替尼耐药基因DUSP9、其筛选方法及应用。
[0005]一种乐伐替尼耐药基因DUSP9，该基因的序列为SEQ ID NO：1。
[0006]乐伐替尼耐药基因DUSP9的筛选方法为使用HuH7细胞株作为目的细胞，利用CRISPR
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Cas9 的高通量功能性筛选技术进行乐伐替尼耐药的差异靶基因筛选，包括以下步骤：
[0007]步骤一：进行预实验，获得sgRNA文库的最佳MOI，确定乐伐替尼的浓度；
[0008]步骤二：进行感染Cas9文库实验，得到稳定株；
[0009]步骤三：稳定株加入乐伐替尼处理，通过PCR扩增和高通量测序，分析sgRNA的富集情况；
[0010]步骤四：筛选乐伐替尼耐药基因；
[0011]步骤五：有效靶基因对肝癌细胞功能表型及介导乐伐替尼耐药的作用验证。
[0012]进一步地，预实验包括：细胞感染预实验、低MOI感染预实验
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荧光、低MOI感染预实验
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抗性、乐伐替尼药物浓度预实验。
[0013]具体地，细胞感染预实验包括：用包装好的GFP慢病毒感染目的细胞，观察不同MOI 值下的感染效率，以确定sgRNA文库的最佳MOI；
[0014]低MOI感染预实验
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荧光包括：以12孔板每孔3E6的细胞量接种靶细胞于培养皿中，病毒原液从
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80℃冰箱取出后冰浴融化，用含5μg/mL Polybrene的新鲜培养基按MOI分别为 0.3，0.5，1和2稀释带有GFP的病毒原液，将含有慢病毒稀释液加到对应细胞中，离心感染 2h。感染6h后，将细胞传出到6cm皿中，感染48h后，收细胞进行流式检测；
[0015]低MOI感染预实验
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抗性包括：以12孔板每孔3E6的细胞量接种靶细胞于培养皿中，病毒原液从
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80℃冰箱取出后冰浴融化，用含5μg/mL Polybrene的新鲜培养基按MOI分别为 0.3，0.5，1和2稀释Cas9sgRNA文库的病毒原液，将含有慢病毒稀释液加到对应细胞中，离心感染2h；感染6h后，将细胞传出到6cm皿中；感染48h后，使用Puro筛选细胞48h，计数；
[0016]乐伐替尼药物浓度预实验包括：将细胞接种到96孔板种，每孔细胞量为5W，接种细胞后第二天，加入浓度为10mM的乐伐替尼母液，根据细胞数量随药物浓度加入量的变化指标，选择细胞变化量最小的浓度作为下一步实验所使用的乐伐替尼浓度。
[0017]进一步地，感染Cas9文库实验包括：
[0018]1)用包装好的lentiCas9
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Blast慢病毒感染HuH7细胞，使用杀稻瘟菌素并得到HuH7
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Cas9 稳定株；
[0019]2)扩增HuH7
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Cas9稳定株细胞，再感染sgRNA文库慢病毒；
[0020]进一步地，稳定株加入乐伐替尼处理，通过PCR扩增和高通量测序，分析sgRNA的富集情况包括：使用乐伐替尼处理上游嘌呤霉素筛选7天后的细胞；将上游细胞等分为两份，一份为0天对照组，另一份为乐伐替尼组；0天对照组收样，冻存在
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80℃；乐伐替尼组持续加药筛选，共筛选21天，期间正常换液或传代，21天后，乐伐替尼抗性细胞得到富集，收样提取DNA；使用特异性引物扩增目的产物并回收，检测PCR效果，进行二代测序，对以上每个样本中的每一种sgRNAreads富集数进行统计，统计各样本中不同sgRNA对应的基因上富集到的reads数，对不同样本的比较组合的sgRNA富集的reads进行聚类分析，根据sgRNA 富集的reads支持数差异筛选出候选基因后，富集分析研究候选基因在GeneOntology中的分布状况以阐明实验中样本候选在基因功能上的体现。
[0021]进一步地，筛选乐伐替尼耐药基因包括：
[0022]1)sgRNA载体构建：首先合成gRNA序列的单链DNAoligo，然后退火配对产生双链 DNAoligo，再通过其两端所含酶切位点将其直接连入酶切后的CRISPR/Cas9载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落进行测序鉴定，比对正确的克隆即为构建成功的CRISPR/Cas9载体；
[0023]2)慢病毒包装：用构建的慢病毒载体和包装质粒共转染293T细胞，包装病毒，收集病毒原液，超滤浓缩，并测定滴度；
[0024]3)稳转株构建：第一天，培养Huh7
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Cas9细胞至对数生长期，悬浮细胞直接收样；计算所需sgRNA慢病毒颗粒数，吸取病毒液加入细胞中，将管中混合溶液吸出加入对应的孔板中，补充培养基至半量体系；离心感染后细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱，过夜培养；第二天，感染16h后，观察细胞状态；若状态明显变差，则及时吸出含慢病毒颗粒的培养液，更
换为全量新鲜培养基；若状态正常，则补液至全量培养基即可，第三天本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乐伐替尼耐药基因DUSP9，其特征在于：该基因的序列为SEQ ID NO：1。2.根据权利要求1所述的一种乐伐替尼耐药基因DUSP9的筛选方法，其特征在于：使用HuH7细胞株作为目的细胞，利用CRISPR
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Cas9的高通量功能性筛选技术进行乐伐替尼耐药的差异靶基因筛选，该方法包括以下步骤：步骤一：进行预实验，获得sgRNA文库的最佳MOI，确定乐伐替尼的浓度；步骤二：进行感染Cas9文库实验，得到稳定株；步骤三：稳定株加入乐伐替尼处理，通过PCR扩增和高通量测序，分析sgRNA的富集情况；步骤四：筛选乐伐替尼耐药基因；步骤五：有效靶基因对肝癌细胞功能表型及介导乐伐替尼耐药的作用验证。3.根据权利要求2所述的一种乐伐替尼耐药基因DUSP9的筛选方法，其特征在于：预实验包括：细胞感染预实验、低MOI感染预实验
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荧光、低MOI感染预实验
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抗性、乐伐替尼药物浓度预实验。4.根据权利要求3所述的一种乐伐替尼耐药基因DUSP9的筛选方法，其特征在于：细胞感染预实验包括：用包装好的GFP慢病毒感染目的细胞，观察不同MOI值下的感染效率，以确定sgRNA文库的最佳MOI；低MOI感染预实验
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荧光包括：以12孔板每孔3E6的细胞量接种靶细胞于培养皿中，病毒原液从
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80℃冰箱取出后冰浴融化，用含5μg/mL Polybrene的新鲜培养基按MOI分别为0.3，0.5，1和2稀释带有GFP的病毒原液，将含有慢病毒稀释液加到对应细胞中，离心感染2h；感染6h后，将细胞传出到6cm皿中，感染48h后，收细胞进行流式检测；低MOI感染预实验
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抗性包括：以12孔板每孔3E6的细胞量接种靶细胞于培养皿中，病毒原液从
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80℃冰箱取出后冰浴融化，用含5μg/mL Polybrene的新鲜培养基按MOI分别为0.3，0.5，1和2稀释Cas9sgRNA文库的病毒原液，将含有慢病毒稀释液加到对应细胞中，离心感染2h；感染6h后，将细胞传出到6cm皿中；感染48h后，使用Puro筛选细胞48h，计数；乐伐替尼药物浓度预实验包括：将细胞接种到96孔板种，每孔细胞量为5W，接种细胞后第二天，加入浓度为10mM的乐伐替尼母液，根据细胞数量随药物浓度加入量的变化指标，选择细胞变化量最小的浓度作为下一步实验所使用的乐伐替尼浓度。5.根据权利要求2所述的一种乐伐替尼耐药基因DUSP9的筛选方法，其特征在于：感染Cas9文库实验包括：1)用包装好的lentiCas9
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Blast慢病毒感染HuH7细胞，使用杀稻瘟菌素并得到HuH7
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Cas9稳定株；2)扩增HuH7
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Cas9稳定株细胞，再感染sgRNA文库慢病毒。6.根据权利要求2所述的一种乐伐替尼耐药基因DUSP9的筛选方法，其特征在于：稳定株加入乐伐替尼处理，通过PCR扩增和高通量测序，分析sgRNA的富集情况包括：使用乐伐替尼处理上游嘌呤霉素筛...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢永刚，张洁，何沙，刘永东，孙一帆，黄文杰，陈贤华，孙林，肖笑荣，
申请(专利权)人：柳州市柳铁中心医院，
类型：发明
国别省市：