全禽源遗传系统及其在制备H7N9禽流感疫苗中的应用技术方案

本发明专利技术公开了一种全禽源反向遗传操作系统及其在制备H7N9亚型禽流感疫苗中的应用。所述全禽源反向遗传操作系统为H5N2亚型禽流感D7株的八质粒反向遗传操作系统（D7系统），为分别包含H5N2亚型禽流感D7株PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS 8个基因片段的重组质粒。所述H7N9亚型禽流感疫苗由高致病性H7N9亚型禽流感流行毒株改造后的HA基因和NA基因与H5N2亚型禽流感D7系统的六个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS构成。所述重组病毒能在鸡胚上保持良好的生长滴度和抗原性，且以D7系统为骨架拯救出的重组禽流感病毒为无致病力毒株，完全满足生物安全性要求，具有较大的应用前景。具有较大的应用前景。具有较大的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
全禽源遗传系统及其在制备H7N9禽流感疫苗中的应用


[0001]本专利技术涉及反向遗传学技术和动物传染病
，更具体地，涉及一种全禽源反向遗传操作系统及其在制备H7N9亚型禽流感疫苗中的应用。

技术介绍

[0002]禽流感（Avian influenza，AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的一种感染和/或疾病综合征，严重影响家禽养殖业的发展并威胁人类健康，家禽感染后可表现出不同的临床症状，根据致病性不同可将其分为低致病性禽流感（Low pathogenic avian influenza，LPAI）和高致病性禽流感（Highly pathogenic avian influenza，HPAI）。2013年出现的低致病性H7N9亚型禽流感病毒在我国禽群和人群中广泛流行，而2016年下半年，广东地区出现了高致病性H7N9亚型禽流感变异株，并迅速在养殖场和人群中传播和流行。H7N9亚型禽流感病毒进化和变异迅速，对动物和人类产生极大威胁，快速研制保护性好的禽流感疫苗十分重要。
[0003]为了满足大规模生产要求，减少由于疫苗供应不足或免疫效果差等原因造成的损失，迫切需要制备出免疫保护效果理想的疫苗株。因此，必须对流行毒株进行改造，除保持原有的免疫原性、消除其致病能力外，还要提高疫苗候选株在鸡胚培养过程中的病毒滴度。利用反向遗传学技术构建禽流感疫苗是目前主要的技术手段，然而现有技术中通过选择利用人流感疫苗骨架来构建重组禽流感疫苗（例如：Hoffmann E,Krauss S, Perez D et al. Eight
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plasmid system forrapid generation of influenza virus vaccines. Vaccine, 2002, 20:3165
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3170），由于含有人源基因，容易造成重组禽流感疫苗感染人类的风险。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种全禽源反向遗传操作系统。
[0005]本专利技术的第二个目的在于提供所述全禽源反向遗传操作系统在制备H7N9亚型禽流感疫苗中的应用。
[0006]本专利技术的第三个目的在于提供一种H7N9亚型禽流感重组毒株。
[0007]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一种基于H5N2亚型禽流感D7株的全禽源反向遗传操作系统（D7系统），为H5N2亚型禽流感D7株的八质粒反向遗传操作系统，所述八质粒为分别包含H5N2亚型禽流感D7株PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS 8个基因片段的重组质粒；所述D7株的八个内部基因PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～8所示。
[0008]所述以H5N2亚型禽流感D7株制备的疫苗为华南农业大学于2013年研制出的全球第一个全禽源的水禽专用H5N2亚型禽流感灭活疫苗；本专利技术利用该水禽专用且高度适应鸡胚的禽流感病毒D7株，建立了基于D7株的八质粒反向遗传操作系统（D7系统）用于禽流感疫
苗开发。以D7系统为骨架拯救出重组禽流感病毒的全部基因片段都来自禽源，这保留了禽流感病毒与人流感病毒之间所固有的种间屏障，降低了重组禽流感疫苗感染人类的风险，完全满足生物安全性要求。
[0009]优选地，所述重组质粒为pSMC
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PB2，pSMC
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PB1，pSMC
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PA，pSMC
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HA，pSMC
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NP，pSMC
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NA，pSMC
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M，pSMC
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NS。
[0010]具体地，所述pSMC载体的构建方法为将pCI载体质粒上的BsmBI酶切位点去除，得到pCI
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NEW，通过基因合成的方式得到转录启动子序列、终止子序列以及转录元件；最后将载体pCI
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NEW及获得的转录元件用XhoI、MluI双酶切，酶切鉴定为阳性的质粒即为pSMC。
[0011]本专利技术基于D7系统能够快速生产出与流行毒株匹配的H7N9亚型禽流感疫苗株，对于防控高致病性H7N9亚型禽流感有重要意义。因此本申请请求保护上述任一所述全禽源反向遗传操作系统在制备禽流感疫苗中的应用。
[0012]优选地，所述禽流感疫苗为H7N9亚型禽流感疫苗的应用。
[0013]本专利技术还提供一种H7N9亚型禽流感重组毒株，是由高致病性H7N9亚型禽流感流行毒株改造后的HA基因和NA基因与D7系统的六个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS构成；所述改造后的HA基因序列如SEQ ID NO：9所示，NA基因序列如SEQ ID NO：10所示。D7系统的六个内部基因与高致病性H7N9亚型禽流感流行毒株改造后的HA基因和NA基因“6+2”组合拯救出的重组病毒能在鸡胚上保持良好的生长滴度和抗原性。
[0014]优选地，所述高致病性H7N9亚型禽流感流行毒株为A/Chicken/Liaoning/19155/2019（H7N9，LN155株）。
[0015]本专利技术还提供所述H7N9亚型禽流感重组毒株的制备方法，是将高致病性H7N9亚型禽流感流行毒株改造后的HA基因和NA基因与D7系统的六个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS一起拯救出重组病毒，即得。
[0016]具体地，所述方法具体包括构建分别表达D7系统的6个质粒即PB2、PB1、PA、NP、M、NS和构建分别表达SEQ ID NO：9所述序列的改造后HA基因和SEQ ID NO：10所述序列NA基因的2个质粒，将所述8种质粒混合，并与转染试剂加入到293T细胞中，培养后获得H7N9亚型禽流感重组病毒株。
[0017]本专利技术通过修饰高致病性H7N9亚型禽流感病毒LN155株的HA基因的裂解位点（由PEVPKRKRTAR/GLF改造为PEVPKG
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R/GLF），随后将NA基因和裂解位点修饰后的HA基因与D7系统的六个内部基因以“6+2”的形式重配转染293T细胞，成功拯救出重组病毒。
[0018]作为一种优选地实施方式，本专利技术还提供所述H7N9亚型禽流感灭活疫苗的制备方法，具体包括如下步骤：（1）反向遗传八质粒系统载体pSMC的构建首先利用PCR技术将pCI载体质粒（Promega公司产品）上的BsmBI酶切位点去除，得到pCI
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NEW，通过基因合成的方式得到转录启动子序列、终止子序列以及转录元件；最后将载体pCI
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NEW及获得的转录元件用XhoI、MluI双酶切，将酶切鉴定为阳性的质粒命名为pSMC。
[0019]（2）D7反向遗传系统的构建与验证将扩增出的D7株的8个基因片段（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS）连接到反向遗传载体pSMC，阳性质粒分别命名为p本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于H5N2亚型禽流感D7株的全禽源反向遗传操作系统，其特征在于，为H5N2亚型禽流感D7株的八质粒反向遗传操作系统，所述八质粒为分别包含H5N2亚型禽流感D7株PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS 8个基因片段的重组质粒；所述D7株的八个内部基因PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～8所示。2.根据权利要求1所述全禽源反向遗传操作系统，其特征在于，所述重组质粒为pSMC
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PB2，pSMC
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PB1，pSMC
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PA，pSMC
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HA，pSMC
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NP，pSMC
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NA，pSMC
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M，pSMC
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NS。3.根据权利要求2所述全禽源反向遗传操作系统，其特征在于，所述pSMC载体的构建方法为将pCI载体质粒上的BsmBI酶切位点去除，得到pCI
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NEW，通过基因合成的方式得到转录启动子序列、终止子序列以及转录元件；最后将载体pCI
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NEW及获得的转录元件用XhoI、MluI双酶切，酶切鉴定为阳性的质粒即为pSMC。4.权利要求1～3任一所述全禽源反向遗传操作系统在制备H7N9亚型禽流感疫苗中的应用。5.一种H7N9亚型禽流感重组毒株，其特征在于，由高致病性H7N9...

【专利技术属性】
技术研发人员：亓文宝，廖明，陈意群，李华楠，李波，张家豪，邱子雯，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：