靶向HBV核心启动子的药物筛选细胞模型、Triciribine及结构类似物新应用制造技术

本发明专利技术公开了一种质粒pcore

【技术实现步骤摘要】
靶向HBV核心启动子的药物筛选细胞模型、Triciribine及结构类似物新应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学和生物医药
，具体涉及一种靶向HBV核心启动子的药物筛选细胞模型、Triciribine及其结构类似物的新应用。

技术介绍

[0002]目前，全球乙肝病毒携带者约有3.5亿患者，我国6
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7％的人群(约8000万)处于病毒携带状态。病毒携带者可发展为慢性乙型肝炎，慢乙肝患者与普通人群相比，发生肝硬化、肝癌的风险更高，全球每年约100万人死于HBV感染相关的肝脏疾病。因此，治疗慢性HBV感染，阻止其致死性后果是事关公共健康的重要问题。
[0003]目前，用于乙肝治疗的药物包括α干扰素(IFN
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α，PEG
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IFNα)和6种核苷(酸)类似物(拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦、替诺福韦阿拉酚胺)。长效干扰素治疗48周后，仅少数患者可获得持续应答，且副作用明显。核苷(酸)类似物在大多数患者中均表现出较强的病毒抑制效果，它们可在一定时期内降低多数患者的血清HBV载量，改善转氨酶水平及肝脏组织学表现。然而，核苷(酸)类药物治疗也存在停药后反弹，长期用药可能筛选耐药突变株的问题。总之，现有治疗药物还远不足以彻底解决乙肝问题。正因为如此，开发新型抗HBV药物十分必要。
[0004]对HBV而言，有效的药物靶点应该针对病毒生活周期的关键环节。众所周知，共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)是HBV生命周期的一个关键分子。病毒感染细胞后，其松弛环状DNA(relaxed circular DNA,rcDNA)基因组转运入核，转变成游离于染色体的cccDNA。cccDNA是所有HBV病毒mRNA的转录模板，它的持续存在，也是现有抗病毒治疗后病毒持续存在或反弹的主要原因。阻断并清除细胞内cccDNA库，可以完全清除HBV，已成为领域内的普遍共识。然而，目前各种抗病毒治疗方案中，缺少以cccDNA为靶点的药物。
[0005]靶向cccDNA的药物，最终可以通过两种途径发挥作用：降低cccDNA的数量或者抑制其功能。cccDNA的主要功能，是作为所有HBV mRNA的转录模板，这些mRNA中很重要的是pgRNA，因其是子代病毒DNA合成的模板，同时也是核心蛋白和聚合酶的翻译模板。控制pgRNA转录的，是核心启动子。因此，抑制核心启动子的转录活性，即是在很大程度上抑制了cccDNA的功能。然而，目前为止，尚无能有效抑制核心启动子转录活性的药物上市。

技术实现思路

[0006]本专利技术的专利技术人在研究过程中，构建了一种靶向HBV核心启动子转录的抗HBV药物筛选细胞模型，然后利用该模型，进行了化合物筛选，筛选到了能抑制HBV核心启动子转录和HBV复制的化合物，这些药物具有进一步发展为乙肝治疗候选药物的潜力。基于此，本专利技术要求保护如下技术方案：
[0007]一种质粒pcore
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HU
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SMAR，其骨架载体是质粒PCMV
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Gluc，在所述骨架载体中插入
有：由HBV核心启动子驱动表达的HiBiT
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unaG融合基因，所述HiBiT
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unaG融合基因通过T2A序列与嘌呤霉素抗性基因相连，在嘌呤霉素抗性基因和polyA序列之间插入SMAR序列，所述HiBiT
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unaG融合基因是荧光素酶标签HiBiT和荧光蛋白报告基因UnaG的融合基因，所述SMAR序列是位于人IFNβ基因上游的序列。
[0008]上述技术方案中，所述荧光素酶标签HiBiT和荧光蛋白报告基因UnaG通过G4S接头序列连接，所述HBV核心启动子、HiBiT、G4S接头序列、UnaG、T2A序列、嘌呤霉素抗性基因、SMAR序列和骨架载体的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～8所示；
[0009]所述质粒pcore
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HU
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SMAR的核苷酸序列为SEQ ID NO.1～8所示的序列依次连接得到的序列。
[0010]上述的质粒pcore
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HU
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SMAR的构建方法，包括以下步骤：
[0011]1)构建质粒puro
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SMAR：以质粒PCH9
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puro为模板，用引物R puro和F SV40GG2扩增载体片段frag1；扩增得到SMAR序列frag2，将frag1和frag2连接起来得到质粒puro
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SMAR；
[0012]2)构建质粒pcore
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UnaG：以质粒PCH9/3091为模板，用引物F1070GG及R1901GG扩增包含增强子I、增强子II和基本核心启动子的区域，将扩增产物回收片段命名为frag3；扩增UnaG基因片段frag4；以质粒PCMV
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Gluc为模板，用引物F SV40和R CMV扩增载体片段frag5，将所述frag3、frag4、frag5连接起来得到质粒pcore
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UnaG；
[0013]3)构建质粒pcore
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HiBiT
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UnaG：以质粒pcore
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UnaG为模板，用引物F UnaG2和R 1901H扩增载体片段frag6；以质粒47G4S
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HBc为模板，用引物F H
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GS和R GS GG扩增包含甘氨酸
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丝氨酸接头序列的片段frag7，将所述frag6、frag7接起来得到质粒pcore
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HiBiT
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UnaG；
[0014]4)构建质粒pcore
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HU
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SMAR：以质粒pcore
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HiBiT
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UnaG为模板，用引物R UnaG
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2A和F SV40GG扩增DNA片段frag8；以质粒puro
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SMAR为模板，用引物F puro
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2A和R SMAR 2扩增DNA片段frag9，将frag8、frag9连接起来得到质粒pcore
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HU
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SMAR。
[0015]一种靶向HBV核心启动子的药物筛选细胞模型，是将上述的质粒pcore
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HU
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SMAR转染小鼠肝细胞系AML12，通过嘌呤霉素筛选和连续传代，获得pCore
‑
AML12细胞。
[0016]所述传代培养的传代间隔为3天，总共至少可传30代。
[0017]上述的靶向HBV核心启动子的药物筛选细胞模型的构建方法，采取前述的方法制备质粒pcore
‑
HU
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...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种质粒pcore
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HU
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SMAR，其特征在于：其骨架载体是质粒PCMV
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Gluc，在所述骨架载体中插入有：由HBV核心启动子驱动表达的HiBiT
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unaG融合基因，所述HiBiT
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unaG融合基因通过T2A序列与嘌呤霉素抗性基因相连，在嘌呤霉素抗性基因和polyA序列之间插入SMAR序列，所述HiBiT
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unaG融合基因是荧光素酶标签HiBiT和荧光蛋白报告基因UnaG的融合基因，所述SMAR序列是位于人IFNβ基因上游的序列。2.如权利要求1所述的质粒pcore
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HU
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SMAR，其特征在于：所述荧光素酶标签HiBiT和荧光蛋白报告基因UnaG通过G4S接头序列连接，所述HBV核心启动子、HiBiT、G4S接头序列、UnaG、T2A序列、嘌呤霉素抗性基因、SMAR序列和骨架载体的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～8所示；所述质粒pcore
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HU
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SMAR的核苷酸序列为SEQ ID NO.1～8所示的序列依次连接得到的序列。3.如权利要求1或2所述的质粒pcore
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HU
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SMAR的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)构建质粒puro
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SMAR：以质粒PCH9
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puro为模板，用引物Rpuro和F SV40GG2扩增载体片段frag1；扩增得到SMAR序列frag2，将frag1和frag2连接起来得到质粒puro
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SMAR；2)构建质粒pcore
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UnaG：以质粒PCH9/3091为模板，用引物F1070GG及R1901GG扩增包含增强子I、增强子II和基本核心启动子的区域，将扩增产物回收片段命名为frag3；扩增UnaG基因片段frag4；以质粒PCMV
‑
Gluc为模板，用引物F SV40和R CMV扩增载体片段frag5，将所述frag3、frag4、frag5连接起来得到质粒pcore
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UnaG；3)构建质粒pcore
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HiBiT
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UnaG：以质粒pcore
‑
UnaG为模板，用引物F UnaG2和R 1901H扩增载体片段frag6；以质粒47G4S
‑
HBc为模板，用引物F H
‑
GS和R GS ...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡接力，黄爱龙，甘春杨，魏霞飞，黄露义，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：