一种电转染永生化树突状细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种电转染永生化树突状细胞的方法，属于细胞电转化技术领域，所述方法，包括以下步骤：1)永生化树突状细胞用电转缓冲液重悬后与待转染的DNA或RNA混合、冰浴获得电转液；2)对所述电转液进行电击处理获得电击后的细胞，所述电击的电压为150～400V，所述电击的电极间距为2～4mm；所述电击的场强为750～1000V/cm；所述电击的时间为3～5ms；3)将所述电击后的细胞置于培养基中培养。本发明专利技术提供的电转染永生化树突状细胞的方法针对永生化树突状细胞，24h细胞存活率高，转染效率高。转染效率高。

【技术实现步骤摘要】
一种电转染永生化树突状细胞的方法


[0001]本专利技术属于细胞电转化
，尤其涉及一种电转染永生化树突状细胞的方法。

技术介绍

[0002]树突状细胞(DC)是哺乳动物免疫系统中功能最强大的抗原呈递细胞。作为免疫系统的哨兵，树突状细胞以相当低的频率存在于宿主生物和环境界面的组织中，即皮肤、粘膜和次级淋巴器官(Banchereau J,Steinman R M.Dendritic cells and the control of immunity[J].Nature,1998,392(6673):245
‑
252)。体内DC来源于造血祖细胞，如巨噬细胞/DC祖细胞(MDPs)，它们依次产生传统的DC前体细胞和单核细胞及其后代(Geissmann F,Manz M G,Jung S,et al.Development of monocytes,macrophages,and dendritic cells[J].Science,2010,327(5966):656
‑
661.)。传统上，所有抗原提呈细胞都可以将外源性捕获的抗原作为MHC II相关肽(对CD4+T细胞)；所有抗原提呈细胞都可以将内源性抗原作为MHC I相关肽(对CD8+T细胞)。然而，树突状细胞可以完成常规呈递和交叉呈递，即将外源捕获的抗原呈递为MHC I相关肽，从而诱导更有效的CD4+和CD8+T细胞活性(DudekAM,Martin S,Garg A D,et al.Immature,semi
‑/>mature,and fully mature dendritic cells:toward a DC
‑
cancer cells interface that augments anticancer immunity[J].Frontiers in immunology,2013,4:438.；Mempel T R,Henrickson S E,Von Andrian U H.T
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cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinctphases[J].Nature,2004,427(6970):154
‑
159.)。DC有潜力在抗肿瘤或抗病原体疫苗或作为自身免疫的调节剂领域用作治疗工具，某些时候需要对DC进行基因修饰。目前科学家们已经探索了几种将基因导入DC的策略，分为病毒和非病毒策略(Humbert J M,Halary F.Viral and non
‑
viral methods to genetically modify dendritic cells[J].Current gene therapy,2012,12(2):127
‑
136.)。与非病毒系统相比，病毒基因传递系统虽然通常更有效，但对其临床应用的安全性、生产“临床级”病毒储备和抗病毒反应的潜在增强仍是主要障碍。
[0003]电穿孔(Electroporation)是生物科学中常用的一种方法，它利用高压电击将DNA、RNA和蛋白质等分子导入细胞。电穿孔利用的是细胞膜充当不能传递电流(离子通道除外)的电容器这一事实，将膜置于高压电场下会导致膜暂时破裂，并形成大到足以让大分子以及小分子进入或离开细胞的孔洞，而细胞膜上的孔洞可在后续培养过程中自行恢复。核酸在体内具有已被证明的安全记录，并已用于病毒和肿瘤疫苗接种试验。临床级DNA和RNA可以快速且经济有效地大量生产，并且长期储存稳定。通过电穿孔进行DNA或RNA转染是一种可能适用于所有细胞类型的技术，与其他转染方法相比，使用非病毒载体的基因转移通常被认为是安全的，但其缺点是转染效率较低。
[0004]电穿孔的一般步骤为将细胞与DNA或RNA混合后置于适当的电穿孔缓冲液中，并放入电击杯中。将电击杯连接到电源，细胞受到规定大小和持续时间的高压电脉冲。电击后
DNA或RNA穿过细胞膜孔洞进入细胞中，将细胞放入正常生长的培养基中，细胞膜上的孔洞可自行恢复。电穿孔设备通常使用两种不同的方法控制脉冲持续时间和电压，一种是使用电容放电系统来产生指数衰减的电流脉冲，另一种是产生真正的方波(或其近似值)。
[0005]目前的电穿孔技术主要针对的常规细胞，对于永生化的树突状细胞并没有一种高效的电转染方法。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种电转染永生化树突状细胞的方法，所述方法针对永生化树突状细胞，24h细胞存活率高，转染效率高。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了一种电转染永生化树突状细胞的方法，包括以下步骤：1)永生化树突状细胞用电转缓冲液重悬后与待转染的DNA或RNA混合、冰浴获得电转液；2)对所述电转液进行电击处理获得电击后的细胞，所述电击的电压为150～400V，所述电击的电极间距为2～4mm；所述电击的场强为750～1000V/cm；所述电击的时间为3～5ms；3)将所述电击后的细胞置于培养基中培养。
[0009]优选的，所述重悬后的永生化树突状细胞的细胞密度为0.5～2
×
107cells/mL。
[0010]优选的，所述待转染的DNA为携带目标基因的DNA质粒。
[0011]优选的，所述携带目标基因的DNA质粒在电转液中的浓度为10～40μg/mL。
[0012]优选的，所述电转缓冲液选自RPMI 1640，Opti
‑
MEM，PBS，DMEM和AIMV中的一种。
[0013]优选的，步骤3)中所述培养基包括80％～95％体积百分含量的AIM V和5％～20％体积百分含量的FBS。
[0014]优选的，所述培养基的温度为30～40℃。
[0015]优选的，步骤1)中所述永生化树突状细胞为对数生长期细胞。
[0016]优选的，步骤1)中所述冰浴的时间为4～6min，所述冰浴的温度为0～10℃。
[0017]优选的，步骤3)中所述电击后的细胞与培养基的体积比为1:5～15。
[0018]本专利技术的有益效果：本专利技术提供的电转染永生化树突状细胞的方法，针对永生化树突状细胞，转染效率高；本专利技术实施例中将质粒DNA通过BTX电穿孔系统转入永生化DC细胞内，利用该质粒在细胞内能够表达GFP的特点，通过流式细胞术检测电穿孔后GFP阳性细胞比例评估转染效率，最高转染效率为48.4％，24h细胞存活率最高为88.5％；本专利技术提供的方法是针对永生化树突状细胞设计的，利用所述方法转染永生化树突状细胞，相比于转染其他细胞包括人急性T细胞白血病细胞系Jurkat和外周血单个核细胞PBMC，转染效率更高。
附图说明
[0019]图1为pMAX质粒的结构图谱；
[0020]图2为流式细胞术检测电击后24h转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种电转染永生化树突状细胞的方法，包括以下步骤：1)永生化树突状细胞用电转缓冲液重悬后与待转染的DNA或RNA混合、冰浴获得电转液；2)对所述电转液进行电击处理获得电击后的细胞，所述电击的电压为150～400V，所述电击的电极间距为2～4mm；所述电击的场强为750～1000V/cm；所述电击的时间为3～5ms；3)将所述电击后的细胞置于培养基中培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重悬后的永生化树突状细胞的细胞密度为0.5～2
×
107cells/mL。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待转染的DNA为携带目标基因的DNA质粒。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述携带目标基因的DNA质粒在电转液中的浓度为10～40μg/...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦顺昌，张嵘，于扬，
申请(专利权)人：焦顺昌，
类型：发明
国别省市：