一种靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞、构建方法及肠癌特异性CTL细胞的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞、构建方法和肠癌特异性CTL细胞的制备方法，属于肿瘤靶向治疗技术领域，所述靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞的构建方法包括以下步骤：1)分析某一肠癌患者的HLA分型和KRAS突变序列组合的亲和力，选择亲和力最高的组合合成融合基因；2)将合成的融合基因连接到表达载体上获得重组载体；3)将所述重组载体转入健康来源的单核细胞，进行诱导培养获得靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞。所述靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞，解决了异体DC与患者HLA分型不匹配的问题，可以刺激更强的免疫反应。所述肠癌特异性CTL细胞对靶细胞具有良好的杀伤效果。

A Kind of Allogeneic Antigen Presenting Cells Targeting KRAS Mutation, Construction Method and Preparation Method of Colorectal Cancer Specific CTL Cells

【技术实现步骤摘要】
一种靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞、构建方法及肠癌特异性CTL细胞的制备方法
本专利技术属于肿瘤靶向治疗
，尤其涉及一种靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞、构建方法和肠癌特异性CTL细胞的制备方法。
技术介绍
肠癌患者中，KRAS突变，是对靶向药抗药的原因之一；因此，KRAS突变患者很难从靶向药中获益，生存期短，因此，迫切需要开发针对KRAS突变的免疫细胞治疗手段。同时，患者来源的树突状细胞DC，数量少，能力差，如果以自体的DC作为KARS的抗原提呈，制备的细胞毒性T淋巴细胞CTL中，特异性细胞比例少，杀伤能力弱。如果是异体DC，HLA又不匹配，无法使用。因此，如何制备高效提呈KRAS突变抗原的DC，并以此DC制备靶向各种KRAS突变的CTL，以杀伤各种KRAS突变的实体肿瘤是目前急需解决的技术难题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞的构建方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：一种靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞的构建方法，包括以下步骤：1)分析某一肠癌患者的HLA分型和KRAS突变序列组合的亲和力，选择亲和力最高的组合合成融合基因；2)将步骤1)中合成的融合基因连接到表达载体上获得重组载体；3)将步骤2)所述重组载体转入健康来源的单核细胞，进行诱导培养获得靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞。优选的，所述分析亲和力的工具为NetMHCpan4.0Server在线软件。优选的，所述融合基因还包括连接HLA分型和KRAS突变序列的剪切肽的编码序列。优选的，所述肠癌患者的HLA分型包括HLA-A0206、HLA-A2601、HLA-B4001、HLA-B1301、HLA-C0304和HLA-C0702。优选的，所述KRAS突变包括KRAS-G12A、KRAS-G12C、KRAS-G12D、KRAS-G12S、KRAS-G12V、KRAS-G13D和KRAS-Q61H。优选的，亲和力最高的组合为HLA-A0206和KRAS-G12D。优选的，所述剪切肽包括P2A、T2A和E2A中的一种。优选的，所述融合基因表达的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo:1所示。本专利技术还提供了所述制备方法制备获得的靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞。本专利技术还提供了一种肠癌特异性CTL细胞的制备方法，包括以下步骤：用所述的靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞与外周血单个核细胞中的T细胞进行共培养20～22d获得肠癌特异性CTL细胞优选的，所述的外周血单个核细胞来源于步骤1)中所述的肠癌患者或者步骤3)中所述的单核细胞的提供者。本专利技术的有益效果：本专利技术所述的靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞，利用基因工程的手段，通过将肠癌患者的的HLA分型和KRAS突变序列组合合成融合基因，并将所述融合基因导入健康来源的DC中获得；解决了异体DC与患者HLA分型不匹配的问题，所述靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞，与患者来源的DC相比，具有正常的抗原提呈能力，可以刺激更强的免疫反应。另外本专利技术提供的肠癌特异性CTL细胞的制备方法，通过异体DC诱导获得肠癌特异性CTL细胞，对KRAS突变的靶细胞，具有良好的杀伤效果。流式细胞分析仪检测CTL的细胞表型结果表明，异体DC诱导的CTL细胞，6.16％为NK，16.7％为NKT，76.9％为T细胞，而CD8+细胞超过70％；靶细胞杀伤实验表明，自体DC和异体DC诱导的CTL细胞，对靶细胞均有一定的杀伤作用，且异体DC诱导的CTL对靶细胞的杀伤效率更高。附图说明图1为电泳检测融合基因的表达结果；图2为流式细胞分析仪检测实施例2中制备获得的CTL肠癌特异性的细胞表型；图3为自体DC和异体DC诱导的CTL细胞对靶细胞的杀伤效果。具体实施方式本专利技术提供了一种靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞的构建方法，包括以下步骤：1)分析某一肠癌患者的HLA分型和KRAS突变序列组合的亲和力，选择亲和力最高的组合合成融合基因；2)将步骤1)中合成的融合基因连接到表达载体上获得重组载体；3)将步骤2)所述重组载体转入健康来源的单核细胞，进行诱导培养获得靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞。在本专利技术中，分析某一肠癌患者的HLA分型和KRAS突变序列组合的亲和力，选择亲和力最高的组合合成融合基因。本专利技术对所述肠癌患者没有特殊要求，任意肠癌患者均可。在本专利技术中，HLA分型和KRAS突变序列组合的亲和力分析优选的采用NetMHCpan4.0Server在线软件；本专利技术中所述NetMHCpan4.0Server在线软件的操作采用本领域常规的操作即可。本专利技术在HLA分型和KRAS突变序列组合的亲和力分析后，对所述HLA分型和KRAS突变序列的组合进行亲和力高低排序，从中选择亲和力最高的组合合成融合基因。本专利技术中，所述亲和力最高的组合因人而异，不同肠癌患者筛选出的亲和力最高的组合并不相同。在本专利技术中，所述融合基因还包括连接述HLA分型和KRAS突变序列的剪切肽的编码序列；所述剪切肽优选的包括P2A、T2A和E2A中的一种；本专利技术中，所述P2A的氨基酸序列优选的如SEQIDNO：12所示(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)；所述T2A的氨基酸序列优选的如SEQIDNO：13所示(EGRGSLLTCGDVEENPGP)；所述E2A的氨基酸序列如SEQIDNO：14所示(QCTNYALLKLAGDVESNPGP)。在本专利技术的一个具体实施过程中，所述肠癌患者的HLA分型包括HLA-A0206、HLA-A2601、HLA-B4001、HLA-B1301、HLA-C0304和HLA-C0702；所述KRAS突变包括KRAS-G12A、KRAS-G12C、KRAS-G12D、KRAS-G12S、KRAS-G12V、KRAS-G13D和KRAS-Q61H，氨基酸序列优选的依次如SEQIDNO：3～SEQIDNO：9所示。本专利技术中，所述HLA分型与KRAS突变抗原组合包括：HLA-A0206+KRAS-G12D、HLA-A0206+KRAS-G13D、HLA-A0206+KRAS-G12V、HLA-A0206+KRAS-G12C、HLA-A0206+KRAS-G12S、HLA-A0206+KRAS-G12A、HLA-A0206+KRAS-Q61H、KRAS-G12D+HLA-A0206、KRAS-G13D+HLA-A0206、KRAS-G12V+HLA-A0206、KRAS-G12C+HLA-A0206、KRAS-G12S+HLA-A0206、KRAS-G12A+HLA-A0206和KRAS-Q61H+HLA-A0206；其中亲和力最高的组合为HLA-A0206和KRAS-G12D。在本专利技术中，所述融合基因表达的蛋白质的氨基酸序列优选的如SEQIDNo:1所示。在本专利技术中，编码所述蛋白质的DNA序列可以有多种选择，对此不作限定；优选的为密码子优化后的人工序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术中所述融合基因优选的委托生物科技公司进行合成。本专利技术在获得所述融合基因后，将合成的融合基因连接到表达载体上获得重组载体。本专利技术对所述重组载体的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的重组载体的制备方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞的构建方法，包括以下步骤：1)分析某一肠癌患者的HLA分型和KRAS突变序列组合的亲和力，选择亲和力最高的组合合成融合基因；2)将步骤1)中合成的融合基因连接到表达载体上获得重组载体；3)将步骤2)所述重组载体转入健康来源的单核细胞，进行诱导培养获得靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞。

【技术特征摘要】
1.一种靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞的构建方法，包括以下步骤：1)分析某一肠癌患者的HLA分型和KRAS突变序列组合的亲和力，选择亲和力最高的组合合成融合基因；2)将步骤1)中合成的融合基因连接到表达载体上获得重组载体；3)将步骤2)所述重组载体转入健康来源的单核细胞，进行诱导培养获得靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述分析亲和力的工具为NetMHCpan4.0Server在线软件。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述融合基因还包括连接HLA分型和KRAS突变序列的剪切肽的编码序列。4.根据权利要求1或3所述的构建方法，其特征在于，所述肠癌患者的HLA分型包括HLA-A0206、HLA-A2601、HLA-B4001、HLA-B1301、HLA-C0304和HLA-C0702。5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦顺昌，张嵘，周子珊，
申请(专利权)人：焦顺昌，北京鼎成肽源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11