一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法、细胞和应用技术

本发明专利技术提供了一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法、细胞和应用，属于基因工程技术领域。所述方法包括：将序列通过Bsu36I和BmgBI双酶切位点整合到PB

【技术实现步骤摘要】
一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法、细胞和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法、细胞和应用。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒(2019-nCoV，SARS-CoV-2)是一种β属的冠状病毒，感染该病毒后可导致患者出现发热、干咳、乏力等症状；部分患者会产生严重的肺炎，进而发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等，甚至死亡。SARS-CoV-2病毒通过其表面的囊膜蛋白吸附和进入宿主细胞，从而感染人的呼吸道上皮细胞及肺泡细胞。SARS-CoV-2的囊膜蛋白即刺突蛋白(Spike protein,S)是一种糖蛋白，主要作用于细胞粘附和细胞膜融合。
[0003]S蛋白由S1和S2两个亚基组成，其中S1亚基中包含受体结合结构域(Receptor Binding Domain,RBD)介导吸附作用，S2亚基主要体现融合活性。RBD与细胞表面血管紧张素转换酶2(Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)结合，是病毒和受体相互作用以及病毒入侵细胞的关键因素。RBD是宿主中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。由于目前没有效果非常好的药物、治疗性抗体、疫苗等用于SARS-CoV-2病毒感染的治疗和预防，因此开发针对SARS-CoV-2病毒的疫苗对于健康人的保护及应对病毒的再次爆发是至关重要的。然而，将病毒的全长蛋白作为临床使用的抗原可以引起部分的对于病毒的预防作用，但也常见到临床报道有抗体依赖性增强(Antibody-dependent enhancement，简称ADE)作用，从而产生比未用疫苗者更加严重的病毒感染。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法、细胞和应用，本专利技术将新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域单独进行跨膜的细胞表达，避免了其它S蛋白表位导致的抗体依赖性增强的风险，再将新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域与跨膜蛋白结构域融合后，在动物体内诱发出更佳的中和滴度。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0007]1)将序列通过Bsu36I和BmgBI双酶切位点整合到PB-713质粒中，得到PB-S-RBD-NGFR质粒；所述序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
[0008]2)将所述步骤1)得到的PB-S-RBD-NGFR质粒电转化到K562细胞中，经嘌呤霉素筛选，当活细胞比例持续大于80％时，得到跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞。
[0009]优选的，所述步骤2)嘌呤霉素筛选时的使用浓度为5μg/ml。
[0010]优选的，所述步骤2)电转化的条件包括：560V、30ms。
[0011]优选的，所述步骤2)PB-S-RBD-NGFR质粒的质量与K562细胞的数量比为10μg:1
×
107cells。
[0012]优选的，所述步骤2)筛选的时间在7d以上。
[0013]本专利技术还提供了一种基于上述技术方案所述的制备方法制备得到的跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞，所述细胞的细胞膜上表达信号肽、新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域和跨膜蛋白结构域；
[0014]所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域的氨基酸序列如SRQ ID No.3所示，所述跨膜蛋白结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0015]优选的，编码信号肽的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
[0016]优选的，编码新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
[0017]优选的，编码跨膜蛋白结构域的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
[0018]本专利技术还提供了上述技术方案所述的细胞在制备新型冠状病毒的细胞疫苗中的应用。
[0019]本专利技术的有益效果：
[0020]与新型冠状病毒刺突糖蛋白或者表达该蛋白天然构象的细胞比较，使用本专利技术提供的制备方法制备得到的细胞免疫动物，可以诱导出更高滴度的中和抗体。这种效果源自：
[0021]1、新型冠状病毒刺突糖蛋白中S1亚基内部包含受体结合域RBD，介导病毒与宿主细胞受体血管紧张素转化酶2结合吸附和侵入过程。RBD免疫原性强，在诱导中和抗体方面效果突出，故细胞疫苗选择RBD进一步优化和表达。
[0022]2、表达RBD强度高。在细胞感染新型冠状病毒时，或转染新型冠状病毒基因到细胞中时，可以检测到细胞表面有S蛋白表达。但天然S蛋白为三聚体，跨膜表达能力较差。将S蛋白中RBD结构和有SEQ ID No.4氨基酸序列的跨膜蛋白结构域融合表达时，跨膜表达RBD效率更高。
[0023]3、由于表达RBD强度高于S蛋白天然跨膜结构，因此与新型冠状病毒刺突糖蛋白或者表达该蛋白天然构象的细胞比较，使用这种细胞免疫动物，可以诱导出更高滴度的中和抗体。
附图说明
[0024]图1为Western-Blot结果(Exposure_120.0s)；
[0025]图2为NGFR-RNA胶图；
[0026]图3为RBD-NGFR-RNA胶图；
[0027]图4为电转24h K562-NGFR表达情况，A.K562野生型；B.电转RBD-NGFR的24h后的K562；C.电转NGFR的24h后的K562；
[0028]图5为电转24h K562-RBD表达情况，A.K562野生型；B.电转NGFR的24h后的K562；C.电转RBD-NGFR的24h后的K562；
[0029]图6为K562细胞电转4种新型质粒标签的表达结果；
[0030]图7为K562细胞电转4种新型质粒S-RBD的表达结果；
[0031]图8为抗体IgG的ELISA检测，A，以新型冠状病毒刺突蛋白全长蛋白进行ELISA检测，B，以新冠冠状病毒结合结构域进行ELISA检测；
[0032]图9为PB-S-RBD-NGFR质粒的结构图；
[0033]图10为嵌合蛋白的结构图。
具体实施方式
[0034]本专利技术提供了一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0035]1)将序列通过Bsu36I和BmgBI双酶切位点整合到PB-713质粒中，得到PB-S-RBD-NGFR质粒；所述序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
[0036]2)将所述步骤1)得到的PB-S-RBD-NGFR质粒电转化到K562细胞中，经嘌呤霉素筛选，当活细胞比例持续大于80％时，得到跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞。
[0037]本专利技术将序列通过Bsu36I和BmgBI双本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将序列通过Bsu36I和BmgBI双酶切位点整合到PB-713质粒中，得到PB-S-RBD-NGFR质粒；所述序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；2)将所述步骤1)得到的PB-S-RBD-NGFR质粒电转化到K562细胞中，经嘌呤霉素筛选，当活细胞比例持续大于80％时，得到跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)嘌呤霉素筛选时的使用浓度为5μg/ml。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)电转化的条件包括：560V、30ms。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)PB-S-RBD-NGFR质粒的质量与K562细胞的数量比为10μg:1
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107cells。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦顺昌，张嵘，袁翰，张艳玲，李斯慧，冯向辉，宋文静，吕鹏敏，钟宏东，胡坤，鲁仕豪，
申请(专利权)人：焦顺昌，
类型：发明
国别省市：