一种用于评价靶向EGFRvIII抗原的靶细胞U87MG-EGRL及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种用于评价靶向EGFRvIII抗原的靶细胞U87MG‑EGRL及其构建方法和应用，属于细胞免疫技术领域。本发明专利技术所述靶细胞U87MG‑EGRL为胶质瘤细胞，能表达CAR‑T细胞靶抗原EGFRvIII基因、GFP和Red Luciferase的融合蛋白基因。本发明专利技术所述靶细胞能够高效表达EGFRvIII抗原，既表达GFP基因又表达luciferase基因，可通过luciferase反应评估CAR‑T细胞的杀伤作用，因此可将所述靶细胞应用于体内体外CAR‑T药效学评估。

A Target Cell U87MG-EGRL for Evaluating Targeted EGFRV III Antigen and Its Construction Method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种用于评价靶向EGFRvIII抗原的靶细胞U87MG-EGRL及其构建方法和应用
本专利技术属于细胞免疫
，具体涉及一种用于评价靶向EGFRvIII抗原的靶细胞U87MG-EGRL及其构建方法和应用。
技术介绍
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy，CAR-T免疫疗法)是最近几年来迅速发展起来的一种新型细胞免疫治疗技术。它是通过基因工程技术，将靶向特异识别(单链抗体scFv)、启动免疫活性和攻击肿瘤细胞的元件整合成一个基因，并将其转导入患者自身T淋巴细胞中，并输回患者体内，使患者重新获得特异性识别肿瘤细胞，激活自身T细胞，有针对性地攻击并杀伤所识别的肿瘤细胞的能力。脑胶质瘤是最恶性的肿瘤之一，发展进程很快，据统计胶质瘤患者的平均生存期小于15个月，目前没有特别有效的治疗手段。脑胶质瘤病例中有30％以上的患者有EGFRvIII抗原表达。EGFRvIII是EGFR基因在肿瘤中最常见的突变，公认的肿瘤特异性致瘤突变。EGFRvIII是突变新抗原，在正常组织中不表达，抗原特异性强。靶向EGFRvIII抗原的CAR-T细胞用于治疗脑胶质瘤，特异性强，脱靶毒性低，副作用小，是不错的选择。细胞治疗产品的复杂性和特殊性常使该类产品在非临床研究和临床研究之间存在较大的种群和个体差异，非临床研究阶段甚至可能没有合适的体内外疾病模型进行药效学评价，因此在早期临床试验阶段初步评估产品有效性是十分必要的。针对CAR-T免疫治疗的临床前体内体外药效学研究需要合适的评价体系和工具细胞，如何在体外有更好的杀伤效率评价体系，以及如何在体内对肿瘤的体积进行高效正确评估都是有待解决的问题。目前体外杀伤效率的评价方法包括LDH方法、流式方法等，但是都不能准确评估对靶细胞的杀伤效果。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种用于评价靶向EGFRvIII的靶细胞U87MG-EGRL及其构建方法和应用，所述靶细胞U87MG-EGRL既高效地表达靶抗原EGFRvIII，同时过表达Redluciferase基因，为CAR-T细胞的体内体外药效学功能验证提供了有效的工具细胞。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种用于评价靶向EGFRvIII的靶细胞U87MG-EGRL，所述靶细胞U87MG-EGRL为胶质瘤细胞，能表达CAR-T细胞靶抗原EGFRvIII基因、GFP和RedLuciferase的融合蛋白基因。优选的，所述EGFRvIII基因由CMV启动子启动表达，所述EGFRvIII基因具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。优选的，所述GFP和RedLuciferase的融合蛋白基因中包括顺次连接的GFP基因、连接肽基因和RedLuciferase基因，所述GFP和RedLuciferase的融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。本专利技术还提供了所述靶细胞U87MG-EGRL的构建方法，包括以下步骤：(1)对所述EGFRvIII基因进行修饰，得修饰后的EGFRvIII靶抗原序列；所述修饰后的EGFRvIII靶抗原序列的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；(2)用慢病毒转染法将所述GFP和RedLuciferase的融合蛋白基因转入胶质瘤细胞获得表达融合蛋白的U87MG-GRL细胞；(3)用慢病毒转染法将步骤(1)得到的所述修饰后的EGFRvIII靶抗原序列转入所述U87MG-GRL细胞中，获得靶细胞U87MG-EGRL；步骤(1)和步骤(2)不存在时间上的限制关系。优选的，步骤(1)所述修饰，包括在所述EGFRvIII基因的5’端添加NheI酶切位点和Kozak序列，在3’端添加NotI酶切位点。本专利技术还提供了所述靶细胞U87MG-EGRL或利用所述构建方法构建得到的靶细胞U87MG-EGRL在靶抗原表达检测中的应用。本专利技术还提供了所述靶细胞U87MG-EGRL或利用所述构建方法构建得到的靶细胞U87MG-EGRL在体外检验CAR-T细胞杀伤效果中的应用。本专利技术还提供了所述靶细胞U87MG-EGRL或利用所述构建方法构建得到的靶细胞U87MG-EGRL在体内成瘤实验中的应用。优选的，所述靶细胞U87MG-EGRL在应用时的浓度为(6～10)×103个/mL，效靶比为(1～20)：1。本专利技术提供了一种用于评价靶向EGFRvIII的靶细胞U87MG-EGRL，所述靶细胞U87MG-EGRL为胶质瘤细胞，能表达CAR-T细胞靶抗原EGFRvIII基因、GFP和RedLuciferase的融合蛋白基因。本专利技术所述靶细胞U87MG-EGRL可用于检验CAR-T细胞药效，是能够同时表达CAR-T细胞靶抗原基因EGFRvIII以及GFP和RedLuciferase的融合蛋白基因的胶质瘤细胞，由于靶细胞为胶质瘤细胞，能够真实地反应CAR-T细胞对胶质瘤的作用，同时在靶细胞中既表达靶细胞抗原，又表达GFP和RedLuciferase的融合蛋白基因，可以有效地区分靶细胞死亡率和效应细胞死亡率，操作快捷灵敏；在体内可以通过小动物成像系统更加精确地反应CAR-T细胞对肿瘤的药效学。附图说明图1为本专利技术实施例中应用的pZX表达载体骨架；图2为本专利技术实施例中携带GFP和RedLuciferase的融合蛋白基因的质粒pZX-GFP-T2A-LUC结构图；图3为本专利技术实施例中携带CAR-T细胞靶抗原EGFRvIII基因的质粒pZX-EGFRvIII结构图；图4为本专利技术实施例中构建的U87MG-GRL细胞系流式检测结果；图5为本专利技术实施例中U87MG-EGRL细胞进行EGFRvIII表达检测结果；图6为本专利技术实施例中U87MG-EGRL细胞进行luciferase检测结果；图7为本专利技术实施例中U87MG-EGRL细胞作为靶细胞应用小动物成像系统进行检测实验结果图；图8为本专利技术实施例中使用CAR-EGFRvIII细胞作为效应细胞，使用U87MG-GRL和U87MG-EGRL作为靶细胞的杀伤率变化曲线图；图9为本专利技术实施例中使用CAR-CD19-T细胞作为效应细胞，使用U87MG-GRL和U87MG-EGRL作为靶细胞的杀伤率变化曲线图。具体实施方式本专利技术提供了一种用于评价靶向EGFRvIII的靶细胞U87MG-EGRL，所述靶细胞U87MG-EGRL为胶质瘤细胞，能表达CAR-T细胞靶抗原EGFRvIII基因、GFP和RedLuciferase的融合蛋白基因。本专利技术所述EGFRvIII基因优选由CMV启动子启动表达，所述EGFRvIII基因具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。本专利技术所述GFP和RedLuciferase的融合蛋白基因中优选包括顺次连接的GFP基因、连接肽基因和RedLuciferase基因，其中所述GFP基因的核苷酸序列优选如SEQIDNO.2所示，所述RedLuciferase的基因序列优选如SEQIDNO.3所示，所述连接肽的基因序列优选如SEQIDNO.4所示。本专利技术将所述GFP基因、连接肽基因和RedLuciferase基因顺次连接后，优选还包括在5’端添加NheI酶切位点以及Kozak序列，在3’端添加NotI酶切位点，从本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于评价靶向EGFRvIII抗原的靶细胞U87MG‑EGRL，其特征在于，所述靶细胞U87MG‑EGRL为胶质瘤细胞，能表达CAR‑T细胞靶抗原EGFRvIII基因、GFP和Red Luciferase的融合蛋白基因。

【技术特征摘要】
1.一种用于评价靶向EGFRvIII抗原的靶细胞U87MG-EGRL，其特征在于，所述靶细胞U87MG-EGRL为胶质瘤细胞，能表达CAR-T细胞靶抗原EGFRvIII基因、GFP和RedLuciferase的融合蛋白基因。2.根据权利要求1所述靶细胞U87MG-EGRL，其特征在于，所述EGFRvIII基因由CMV启动子启动表达，所述EGFRvIII基因具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述靶细胞U87MG-EGRL，其特征在于，所述GFP和RedLuciferase的融合蛋白基因中包括顺次连接的GFP基因、连接肽基因和RedLuciferase基因，所述GFP和RedLuciferase的融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。4.权利要求1～3任一项所述靶细胞U87MG-EGRL的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对所述EGFRvIII基因进行修饰，得修饰后的EGFRvIII靶抗原序列；所述修饰后的EGFRvIII靶抗原序列的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；(2)用慢病毒转染法将所述GFP和RedLuciferase的融合蛋白基因转入胶质瘤细...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦顺昌，张嵘，宋玉洁，
申请(专利权)人：焦顺昌，北京鼎成肽源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11