一种融合蛋白及治疗非小细胞肺癌的重组病毒疫苗和制备方法技术

本发明专利技术提供了一种融合蛋白及治疗非小细胞肺癌的病毒疫苗和制备方法，本发明专利技术属于疫苗技术领域。本发明专利技术提供了一种融合蛋白，包括黏蛋白1(MUC1)抗原元件和黑素瘤抗原家族A3(MAGE‑A3)抗原元件和位于黏蛋白1抗原元件和黑素瘤抗原家族A3抗原元件之间的连接肽；所述连接肽的氨基酸个数为0～20个。所述融合蛋白具有两者的生物学功能，既具有黏蛋白1的免疫原性，又具有黑素瘤抗原家族A3的免疫原性，且所述融合蛋白质可以在两种抗原元件的协同下增强抗肿瘤的效果，维持周期长，免疫宿主广泛，不需要添加佐剂为抗肿瘤等治疗提供新方向。

Fusion protein and recombinant virus vaccine for treating non-small cell lung cancer and preparation method thereof

The invention provides a fusion protein and a virus vaccine for treating non-small cell lung cancer and a preparation method thereof. The invention belongs to the vaccine technical field. The present invention provides a fusion protein comprising a mucin 1 (MUC1) antigen element and a melanoma antigen family A3 (MAGE_A3) antigen element, and a connecting peptide located between the mucin 1 antigen element and the melanoma antigen family A3 antigen element; the amino acid number of the connecting peptide is 0 to 20. The fusion protein has the biological functions of both, has the immunogenicity of mucin 1 and the immunogenicity of melanoma antigen family A3, and the fusion protein can enhance the anti-tumor effect under the cooperation of the two antigen elements, maintain a long cycle, and has a wide range of immune hosts, and does not need to add adjuvants for anti-tumor. Tumors and other treatments provide new directions.

【技术实现步骤摘要】
一种融合蛋白及治疗非小细胞肺癌的重组病毒疫苗和制备方法
本专利技术属于疫苗
，具体涉及一种融合蛋白及治疗非小细胞肺癌的病毒疫苗和制备方法。
技术介绍
非小细胞肺癌，属于肺癌的一种，它包括鳞癌、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比，其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚。非小细胞肺癌约占肺癌总敉的80～85％。临床上非小细胞肺癌的症状表现发热、胸痛、气促、咳嗽、血痰等。很多人都会因为不了解该病初始症状的具体情况而出现误诊，尤其是咳嗽，该症状主要是由于肺部的恶性肿瘤细胞，也即癌细胞持续的刺激患者的呼吸道引发的。目前，手术、化疗、放疗等传统疗法对于早期非小细胞肺癌具有一定的疗效，但一方面化疗、放疗具有较大的副作用，另一方面由于许多肿瘤发现较晚，往往失去手术治疗的最佳机会，所以通过增强机体免疫系统的抗肿瘤作用杀灭肿瘤细胞、达到治疗肿瘤目的的免疫与基因疗法作为肿瘤治疗的一种新模式，成为肿瘤治疗和免疫学研究的热点。MAGE基因的表达产物中MAGE-3蛋白是肿瘤特异性抗原的典型代表。MAGE-3是广泛存在于多种肿瘤的肿瘤特异性抗原，在正常组织中除了胎盘和睾丸低水平表达外，在其他正常成熟组织均不表达，而睾丸是免疫豁免器官，所以，MAGE-3是一种理想的肿瘤相关抗原，可以作为多种肿瘤免疫治疗的靶点。但是MAGE-3作为非小细胞肺癌抗原制备疫苗，由于抗原肽的表位有限，不能包括所有的免疫位点、人工合成的抗原肽的空间结构可能与自然产生的抗原空间结构不同，妨碍产生正常的免疫反应或存在免疫性较低的问题，大大影响免疫治疗。尽管现有技术中常常采用两种细胞抗原融合得到融合蛋白，但是融合蛋白在体外致敏DC的效率一般较低，DC在摄取分子肽后，往往不能有效递呈抗原并激发特异性的CTL，因此如何增强DC对抗原的加工递呈，以期更有效地激发肿瘤抗原特异性的免疫应答仍然是肿瘤免疫治疗研究中亟待解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种融合蛋白及治疗非小细胞肺癌的重组病毒疫苗和制备方法，使所述融合蛋白具有较强的免疫性。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种融合蛋白，包括黏蛋白1抗原元件和黑素瘤抗原家族A3抗原元件；所述黏蛋白1抗原元件和黑素瘤抗原家族A3抗原元件之间还包括连接肽；所述连接肽的氨基酸个数为0～20个。优选的，所述黏蛋白1抗原元件具有如序列表中SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；所述黑素瘤抗原家族A3抗原元件具有如序列表中SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；所述连接肽具有如序列表中SEQIDNo.3所示的氨基酸序列。优选的，所述融合蛋白具有如序列表中SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示的氨基酸序列。本专利技术提供了一种融合蛋白的编码基因，编码所述的融合蛋白。优选的，所述编码基因具有如序列表中SEQIDNo.6所示的核苷酸序列或具有如序列表中SEQIDNo.7所示的核苷酸序列。本专利技术提供了一种治疗非小细胞肺癌的重组病毒疫苗的构建方法，包括以下步骤：1)将所述的编码基因克隆到穿梭质粒中，得到重组穿梭质粒；2)用MVA病毒感染细胞，培养90～120min，得到感染细胞；3)将所述重组穿梭质粒与所述感染细胞混合，37℃培养24～48h，得到单层细胞；4)反复冻融所述单层细胞2～3次，将冻融的细胞破碎处理2～5次，固液分离，得到上清液；5)将所述上清液接种细胞，培养，将得到的病变细胞破碎、分离上清液，得到用于治疗非小细胞肺癌的重组病毒疫苗。优选的，所述步骤2)中培养的时间为100min。优选的，所述步骤1)的穿梭质粒为pIIIdHR-P7.5。优选的，所述步骤3)中培养的时间为36h。本专利技术提供了所述的构建方法得到的重组病毒疫苗，包括所述的融合蛋白的编码基因。本专利技术提供了一种融合蛋白，包括黏蛋白1(MUC1)抗原元件和黑素瘤抗原家族A3(MAGE-A3)抗原元件和位于黏蛋白1抗原元件和黑素瘤抗原家族A3抗原元件之间的连接肽；所述连接肽的氨基酸个数为0～20个。所述融合蛋白具有两者的生物学功能，既具有黏蛋白1的免疫原性，又具有黑素瘤抗原家族A3的免疫原性，且所述融合蛋白质可以在两种抗原元件的协同下增强抗肿瘤的效果，维持周期长，免疫宿主广泛，不需要添加佐剂为抗肿瘤等治疗提供新方向。本专利技术提供了一种治疗非小细胞肺癌的重组病毒疫苗的构建方法，操作简便，重复性好，适合工厂化生产。本专利技术提供了一种治疗非小细胞肺癌的重组病毒疫苗，能够诱导小鼠体内产生特异性免疫反应，并且真核细胞具有天然相似的构象，从而可以被天然蛋白诱生的抗体所识别。附图说明图1为实施例5中不同重组病毒疫苗在细胞中产生抗体的westernblot结果；图2为实施例6中不同重组病毒疫苗免疫小鼠产生的抗体滴度结果折线图。具体实施方式本专利技术提供了一种融合蛋白，包括黏蛋白1抗原元件和黑素瘤抗原家族A3抗原元件和位于黏蛋白1抗原元件和黑素瘤抗原家族A3抗原元件之间的连接肽；所述连接肽的氨基酸个数为0～20个。在本专利技术中，所述连接肽的氨基酸个数优选为4～15个，更优选为6个。所述连接肽的氨基酸种类优选为疏水性强的氨基酸，例如Ser或Gly。在本专利技术中，所述黏蛋白1抗原元件优选具有如序列表中SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；所述黑素瘤抗原家族A3抗原元件优选具有如序列表中SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；所述连接肽具有如序列表中SEQIDNo.3所示的氨基酸序列。在本专利技术中，所述融合蛋白优选具有如序列表中SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示的氨基酸序列。为了便于分离得到融合蛋白，将所述融合蛋白上添加筛选标签。所述标签包括6个组氨酸形成的寡肽。本专利技术提供了一种融合蛋白的编码基因，编码所述的融合蛋白。在本专利技术中，所述编码基因优选具有如序列表中SEQIDNo.6所示的核苷酸序列或具有如序列表中SEQIDNo.7所示的核苷酸序列。本专利技术提供了一种治疗非小细胞肺癌的重组病毒疫苗的构建方法，包括以下步骤：1)将上述方案所述的编码基因克隆到穿梭质粒中，得到重组穿梭质粒；2)用MVA病毒感染细胞，培养90～120min，得到感染细胞；3)将所述重组穿梭质粒与所述感染细胞混合，37℃培养24～48h，得到单层细胞；4)反复冻融所述单层细胞2～3次，将冻融的细胞破碎处理2～5次，固液分离，得到上清液；5)将所述上清液接种细胞，培养，将得到的病变细胞破碎、分离上清液，得到用于治疗非小细胞肺癌的重组病毒疫苗。本专利技术将上述方案提供的编码基因克隆到穿梭质粒中，得到重组穿梭质粒。在本专利技术中，所述克隆用引物包括正向引物和反向引物。所述正向引物为CAGATCTGGagccacagccccggt(SEQIDNo.8)，其中划横线的部分为Bg1II的酶切位点；所述反向引物为CAAGCTTGGtcactcctcgtctttac(SEQIDNo.9)，其中划横线部分为HindIII的酶切位点。采用所述正向引物和反向引物扩增的编码基因中引入双酶切位点，便于后续克隆到质粒。所述编码基因的克隆过程中，退火温度优选为65℃。本专利技术对所述克隆的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的克隆方法即可。本专利技术将克隆得到的编码基因进行Bg1II/HindIII酶切，得到酶切片段。同时将质粒采用同样方法进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其特征在于，包括黏蛋白1抗原元件和黑素瘤抗原家族A3抗原元件；所述黏蛋白1抗原元件和黑素瘤抗原家族A3抗原元件之间还包括连接肽；所述连接肽的氨基酸个数为0～20个。

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，包括黏蛋白1抗原元件和黑素瘤抗原家族A3抗原元件；所述黏蛋白1抗原元件和黑素瘤抗原家族A3抗原元件之间还包括连接肽；所述连接肽的氨基酸个数为0～20个。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述黏蛋白1抗原元件具有如序列表中SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；所述黑素瘤抗原家族A3抗原元件具有如序列表中SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；所述连接肽具有如序列表中SEQIDNo.3所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有如序列表中SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示的氨基酸序列。4.一种融合蛋白的编码基因，其特征在于，编码权利要求1所述的融合蛋白。5.根据权利要求4所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因具有如序列表中SEQIDNo.6所示的核苷酸序列或具有如序列表中SEQIDNo.7所示的核苷酸序列。6.一种治疗非小细胞肺癌的重组病...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦顺昌，张嵘，林童俊，
申请(专利权)人：焦顺昌，北京鼎成肽源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11