一种基于间皮素锚定的哺乳动物融合蛋白展示质粒、细胞系及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种基于间皮素锚定的哺乳动物融合蛋白展示质粒、细胞系及应用，属于抗体筛选技术领域，所述哺乳动物融合蛋白展示质粒，包括顺次连接有编码信号肽的基因、编码待筛选蛋白的基因和编码间皮素的基因的融合基因和初始质粒。本发明专利技术提供的基于间皮素锚定的哺乳动物融合蛋白展示细胞系，将所述哺乳动物融合蛋白展示质粒转入哺乳动物抗体展示细胞获得。本发明专利技术提供的基于间皮素锚定的哺乳动物融合蛋白的展示质粒，利用间皮素融合蛋白即可膜上表达又可分泌表达的特性，实现待筛选蛋白在哺乳动物细胞的展示，能够大大提高待筛选蛋白的筛选效率；待筛选蛋白和间皮素形成的融合蛋白表达效率更高，并且间皮素有直标抗体，能够辅助指示筛选结果。够辅助指示筛选结果。

【技术实现步骤摘要】
一种基于间皮素锚定的哺乳动物融合蛋白展示质粒、细胞系及应用


[0001]本专利技术属于抗体筛选
，尤其涉及一种基于间皮素锚定的哺乳动物融合蛋白展示质粒、细胞系及应用。

技术介绍

[0002]单克隆抗体药物具有较高的靶向性，可以直达病变细胞，能够减少正常细胞受损，减少副作用，因此广泛用于临床。新的单克隆抗体药物的研发主要是通过重组抗体的方式在体外进行抗体文库的构建及筛选。在重组抗体的应用中，常见的展示技术包括噬菌体展示技术、核糖体/mRNA展示技术、酵母表面展示技术等，其中大部分的展示技术都是基于原核表达系统，由于原核表达系统中，表达蛋白过程选择的密码子与真核细胞不同，故用原核表达系统筛选获得的抗体可能无法在体内获得高表达，并且原核表达系统糖基化等翻译后修饰过程与人体表达存在区别，不能很好的应用。
[0003]采用哺乳动物细胞表面展示技术可以克服不同宿主，尤其是克服噬菌体展示过程中，糖基化等翻译后修饰过程与人体表达的区别。通过哺乳动物细胞尤其是人源细胞直接进行抗体展示不仅可以快速筛选大容量的抗体文库，而且无翻译后修饰的问题，容易快速进入下一步的表达和生产。
[0004]然而，现有的哺乳动物展示常用PDGFR等跨膜蛋白的跨膜区域和抗体分子形成融合蛋白的结构。经过流式细胞术筛选表达抗体的细胞时，只能获得跨膜表达抗体分子的候选细胞。为了进一步检测抗体的活力及亲和力，还需要重新进行测序和分子克隆，制备分泌型的抗体。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于间皮素锚定的哺乳动物融合蛋白的展示质粒、细胞系及应用；所述展示质粒可以在哺乳动物细胞中展示蛋白结构，用于筛选功能性抗体或者具有亲和力的蛋白。间皮素融合表达后的蛋白还可以分泌表达，既可以通过流式细胞术筛选膜上型表达蛋白，又可以通过ELISA等液相检测技术筛选分泌蛋白；本专利技术提供的展示质粒具有膜上表达和分泌表达双功能，大大加速了蛋白的筛选速度。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了间皮素在哺乳动物融合蛋白展示中的应用，将所述间皮素与待筛选蛋白在哺乳动物细胞中融合表达。
[0008]本专利技术提供了一种用于哺乳动物细胞展示的融合蛋白，包括顺次连接的信号肽、所述的待筛选蛋白和间皮素。
[0009]优选的，所述间皮素的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0010]优选的，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0011]本专利技术提供了编码所述融合蛋白的融合基因，包括编码信号肽的基因、编码待筛
选蛋白的基因和编码间皮素的基因。
[0012]优选的，所述编码信号肽的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述编码间皮素的基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示。
[0013]本专利技术提供了一种基于间皮素锚定的哺乳动物融合蛋白展示质粒，包括所述融合基因和初始质粒。
[0014]优选的，所述初始质粒为pcDNA
‑
FRT质粒，所述融合基因重组至所述pcDNA
‑
FRT质粒的NheI酶切位点和NotI酶切位点之间。
[0015]本专利技术提供了一种基于间皮素锚定的哺乳动物融合蛋白展示细胞系，将所述哺乳动物融合蛋白展示质粒转入哺乳动物抗体展示细胞获得。
[0016]本专利技术提供了所述的融合蛋白、所述的融合基因、所述的哺乳动物融合蛋白展示质粒、所述的哺乳动物融合蛋白展示细胞系在药物筛选中的应用。
[0017]本专利技术的有益效果：本专利技术提供的基于间皮素锚定的哺乳动物融合蛋白的展示质粒，利用间皮素融合蛋白即可膜上表达又可分泌表达的特性，实现待筛选蛋白在哺乳动物细胞的展示，能够大大提高待筛选蛋白的筛选效率；待筛选蛋白和间皮素形成的融合蛋白表达效率更高，并且间皮素有直标抗体，能够辅助指示筛选结果。本专利技术提供的待筛选蛋白和间皮素形成的融合蛋白不仅能够通过哺乳动物细胞展示技术进行文库筛选，还有部分能够分泌表达，能够通过收集细胞培养上清进一步进行Western Blot或者ELISA实验筛选抗体的活力及亲和力。
附图说明
[0018]图1为单克隆细胞的单点整合效率(Lac基因)的qPCR检测结果，对应表格数据见表1；
[0019]图2为单克隆细胞表达β
‑
半乳糖苷酶的检测结果；
[0020]图3为K562
‑
PB
‑
FRT单克隆细胞转染48h后mScarlet和mTag BFP2的表达效率；
[0021]图4为K562
‑
PB
‑
FRT单克隆细胞转染15d后mScarlet和mTag BFP2的表达效率；
[0022]图5为实施例1中基于间皮素锚定的哺乳动物融合蛋白展示质粒的结构图谱；
[0023]图6为K562
‑
PB
‑
FRT
‑
39
‑
sifi
‑
4D5
‑
MSLN细胞表达MSLN蛋白和4D5抗体的流式分析检测结果；
[0024]图7为实施例3中YH抗体库的构建结果；
[0025]图8为实施例4中S
‑
RBD抗体库的构建结果，其中A为Frist PCR 710～713样本轻链的PCR结果；B为FristPCR 710
‑
713样本重链的PCR结果；C为710～713样本SOE
‑
PCR产物的酶切结果；D为MSLN in pcDNA5载体酶切结果；
[0026]图9为K562
‑
PB
‑
FRT
‑
39
‑
YH
‑
MSLN
‑
pcDNA5抗体库细胞电转48h流式分析结果；
[0027]图10为K562
‑
PB
‑
FRT
‑
39
‑
YH
‑
MSLN
‑
pcDNA5抗体库细胞电转72h流式分选结果；
[0028]图11为K562
‑
PB
‑
FRT
‑
39
‑
YH
‑
MSLN
‑
pcDNA5抗体库细胞cDNA的PCR扩增结果；
[0029]图12为K562
‑
PB
‑
FRT
‑
39
‑
sifi
‑
4D5
‑
MSLN细胞表达胞外蛋白检测结果。
具体实施方式
[0030]本专利技术提供了间皮素在哺乳动物融合蛋白展示中的应用，将所述间皮素与待筛选
蛋白在哺乳动物细胞中融合表达。
[0031]在本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.间皮素在哺乳动物融合蛋白展示中的应用，其特征在于，将所述间皮素与待筛选蛋白在哺乳动物细胞中融合表达。2.一种用于哺乳动物细胞展示的融合蛋白，其特征在于，包括顺次连接的信号肽、权利要求1中所述的待筛选蛋白和间皮素。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述间皮素的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。4.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。5.编码权利要求2～4任意一项所述融合蛋白的融合基因，包括顺次连接的编码信号肽的基因、编码待筛选蛋白的基因和编码间皮素的基因。6.根据权利要求5所述的融合基因，其特征在于，所述编码信号肽的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述编码间皮素的基因的核苷酸序列如SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦顺昌，张嵘，张艳玲，袁翰，
申请(专利权)人：焦顺昌，
类型：发明
国别省市：