一种融合蛋白制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种融合蛋白，所述的融合蛋白通过柔性连接将肿瘤靶向IgG抗体与IL15或其变体或/和IL15α受体胞外段或“sushi domain”或变体进行融合，以构建具有靶向、免疫调节等功能的融合蛋白。所述融合蛋白增强了细胞和细胞因子介导的免疫，可用于治疗肿瘤性和感染性疾病，具有治疗肿瘤、提高组织特异性、降低副作用以及提高药效的作用。用。用。

【技术实现步骤摘要】
一种融合蛋白


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种融合蛋白。

技术介绍

[0002]免疫逃逸是肿瘤细胞逃生的一个非常重要的机制，PD-L1(程序性死亡配体1)以及其与受体PD-1的结合就是其中一个重要路径，因此靶向PD-L1/PD-1的抗体药成为热门的免疫抑制解除剂，和治疗肿瘤的药物。
[0003]PD-L1即CD274或者B7H1，属于I型跨膜配体，包含IgV和IgC样结构，大部分位于胞外，小部分位于细胞质。PD-L1的受体PD-1存在于T细胞表面，两者结合会抑制T细胞的增殖和细胞因子的产生，这种机制作为自然选择的一种方式使肿瘤在免疫反应的环境中得到进化。PD-L1与B7-1也有结合，B7-1是另一种T细胞激活的负性调节者，PD-L1异常表达于多种肿瘤细胞，而且在多种癌症中PD-L1表达的增加与不良的预后有关系。随着免疫的活化和促炎因子的产生，在肿瘤微环境的免疫细胞和其他细胞中，PD-L1也会上调，进一步促进了肿瘤微环境T细胞的抑制。阻断PD-L1可以促进与肿瘤反应的T细胞重新激活，恢复其发现和杀死肿瘤细胞的功能。PD-L1及其受体PD-1(programmed death-1)的信号途径被认为与一直排斥反应、自身免疫疾病、慢性病毒感染、肿瘤免疫逃逸等疾病密切相关。肿瘤细胞及其微环境通过上调PD-L1表达并与肿瘤特异的CD8+T细胞表面的PD-1结合，来限制宿主的免疫反应，从而产生免疫逃逸。因此利用PD-1或PD-L1的单抗针对性阻断PD-1/PD-L1信号通路可恢复T细胞对肿瘤的免疫杀伤功能，能够发挥良好的治疗效果。虽然以PD-1与PD-L1单抗为核心的肿瘤免疫疗法在临床应用中取得不错的效果，但是仍具有一定的局限性：PD-1/PD-L1单抗不能无差别治疗肿瘤病人，使用PD-1/PD-L1单抗治疗的肿瘤病人需先进行生物标记物；通过PD-1/PD-L1信号通路治疗肿瘤的机理研究还不完全明了；此外还有严重的致命并发症，如免疫性肝炎、免疫性肺炎、免疫性肠癌、免疫性心脏炎症甚至免疫性神经系统炎症。
[0004]白细胞介素IL-15是趋化因子家族的一种细胞因子，属于四个小a螺旋束细胞因子家族成员，由活化的单核－巨噬细胞、表皮细胞和成纤维细胞等多种细胞产生。IL-15具有和IL-2相类似的分子结构，并通过与IL-2受体的β链(CD122)和γ链(gc，CD132)与靶细胞结合，发挥类似IL-2的生物学活性。IL-15可诱导B细胞增殖和分化，是唯一能部分取代IL-2诱导初期抗体产生的细胞因子；IL-15能够刺激T细胞和NK细胞增殖，诱导LAK细胞活性，还能与IL-12协同刺激NK细胞产生IFN-γ。白介素15受体由α受体、β受体(CD122)以及γ受体(CD132)组成，其IL-15Rα链与IL-2Rα链的结构相似，为补体调节蛋白(CCP)结构。与IL-2Rα不同，结合力较IL-15R有所不同，IL-15α受体仅具有一个细胞因子结合域“sushi domain”，且IL-15Rα单体与IL15具有较高的亲和力。IL-15/IL-1 5α受体复合物可与免疫细胞表面的IL2/15βc和γc共同作用，通过β、γ受体亚单位能结合并活化酪氨酸激酶Jak-1和Jak-3，导致转录因子STAT-3和STAT-5活化并向细胞核定位；还能诱导B淋巴细胞瘤-2基因，活化丝裂原激酶信号通路，以及非受体型蛋白激酶lck和syk激酶的磷酸化，最终实现对剌激记忆性CD8+T淋巴细胞和NT/NKT细胞增殖。
[0005]自从IL15被发现以来，其在诊断、肿瘤筛查、治疗等很多领域都有所应用；随着研究的不断深入，IL15在肿瘤治疗方面展现非常乐观的前景。但是重组的IL15由于其自身固有的半衰期短、剂量控制难、副作用等缺点，使得其在临床应用受到了限制；在后续的研究中，人们通过融合技术来改善这些不足；专利CN1942481A、专利CN100334112C等中设计通过Fc融合手段来研究IL15的应用；专利CN101360827B、专利WO2015/103928A1中设计通过IL15α受体与IL15融合方式探索IL15的应用。近年来IL15靶点与免疫检测点等治疗性抗体联合应用，优良的结果展示出广阔的应用可能性。IL15联合PD-L1抗体和CTLA4抗体在小鼠CT26结肠癌模型中显著的减少肿瘤肺转移结节、延长模型动物的生存期；IL15超级激动剂(ALT-803)与nivolumab(PD-1抗体)联合治疗非小细胞肺癌已进入临床IIIb/IV期研究。
[0006]CN105263521A公开了一种免疫调节剂，该专利技术提供了一种特异性结合PD-L1的抗体和包含利用IL15受体结合结构域构建的PD-L1结合蛋白的融合分子、编码所述抗体或融合分子的核酸分子以及其治疗性组合物。所述试剂抑制PD-L1介导的免疫抑制并且增强细胞和细胞因子介导的免疫，以用于治疗肿瘤性和感染性疾病。
[0007]本申请通过柔性连接将PD-L1抗体与IL15或/和IL15α受体胞外段进行融合，以构建具有靶向、免疫调节等功能的融合蛋白，利用PD-L1在肿瘤细胞上的高表达将IL15的效应聚焦到肿瘤微环境，减轻IL15对多种组织器官的副作用，是一种治疗效果良好的抗体融合蛋白。

技术实现思路

[0008]术语：
[0009]sushi domain：具有人白介素15受体α活性的胞外域片段的缩短形式。
[0010]Knob into Hole结构：杵臼结构，可以使异源抗体重链有效异源二聚化。
[0011]为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供的一种融合蛋白，采用如下技术方案：
[0012]本专利技术所述融合蛋白包含一种肿瘤靶向抗体、柔性连接以及IL15和/或IL15α受体胞外段，其中所述抗体重链单臂与IL15或其变体和/或IL15α受体胞外段或“sushi domain”或其变体通过柔性连接进行融合。其中，所述抗体包括抗体、片段抗体、纳米抗体，以及药学上可接受的载体，所述IL15包括IL15或其变体；所述IL15α受体胞外段包括IL15α受体胞外段、“sushi domain”或其变体。
[0013]优选地，所述抗体重链上具有Knob into Hole结构。
[0014]根据本专利技术的一个实施方案，所述抗体为PD-L1抗体。
[0015]本专利技术提供一种融合蛋白，该融合蛋白包含PD-L1抗体、IL15和/或IL15α受体胞外段，其中所述PD-L1抗体与IL15和/或IL15α受体胞外段通过柔性连接进行融合。
[0016]进一步地，所述PD-L1抗体的重链包括SEQ ID NO：1。
[0017]优选地，所述PD-L1抗体重链上具有Knob into Hole结构，其中含有Knob突变点S378C和T390W的重链具体序列为SEQ ID NO：2；含有Hole突变位点Y373C、T390S、L392A和Y431V的重链具体序列为SEQ ID NO：3。
[0018]进一步地，所述PD-L1抗体的轻链具有以下本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含一种肿瘤靶向IgG抗体、柔性连接以及IL15和/或IL15α受体胞外段，其中所述IgG抗体重链单臂与IL15和/或IL15α受体胞外段通过柔性连接进行融合。2.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述柔性连接具有以下序列：SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6。3.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，IL15胞外段具有SEQ ID NO：7的序列，IL15α受体胞外段具有SEQ ID NO：8的序列。4.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述IgG抗体包括整个抗体、片段抗体或纳米抗体，以及所述IgG抗体药学上可接受的载体；所述IL15包括其变体；所述IL15α受体胞外段包括“sushi domain”或其变体。5.根据权利要求4所述融合蛋白，其特征在于，所述IgG抗体为PD-L1抗体。6.根据权利要求5所述融合蛋白，其特征在于，所述PD-L1抗体的重链...

【专利技术属性】
技术研发人员：万云超，杨冬美，胡琛霏，周加义，崔文俊，
申请(专利权)人：瑞阳苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：