重组人生长激素Fc融合蛋白和用途及其工程细胞株制造技术

本发明专利技术涉及生物医药工程技术领域，特别是基因重组长效人生长激素技术领域，具体涉及一种重组人生长激素Fc融合蛋白研制。本发明专利技术的人生长激素Fc融合蛋白所述融合蛋白含有人生长激素(hGH)、柔性肽接头(L))和人免疫球蛋白Fc片段。本发明专利技术还公开了该融合蛋白的活性测定方法以及能够表达该融合蛋白的宿主细胞。本发明专利技术构建的重组人生长激素Fc融合蛋白比重组hGH具有更长的血清半衰期，大大降低了治疗时间内所需的注射给药频率，从而提高患者的依从性、增加医患双方的便利性，同时其生产过程也更简单、高效，特别适用于工业化大规模制备基因重组长效人生长激素。组长效人生长激素。组长效人生长激素。

【技术实现步骤摘要】
重组人生长激素Fc融合蛋白和用途及其工程细胞株


[0001]本专利技术涉及生物医药工程
，特别是基因重组长效人生长激素
，具体涉及一种重组人生长激素Fc融合蛋白研制和用途及其工程细胞株。

技术介绍

[0002]生长激素(HGH)是一种肽类激素，它是由垂体中的生长激素细胞合成、存储和分泌。成熟野生型人GH(由SEQ ID NO:2鉴别的hGH)是由191个氨基酸残基构成，其中大部分是以分子量22KDa形式存在，少量生长激素以20KDa形式存在，等电点为4.9，在53、165、182和189位置含有4个半胱氨酸残基，其通过形成分别连接C53与C165和C182与C189的两个分子内二硫键，稳定蛋白的三维结构。生长激素与其特异生长激素受体(hGHR)在靶点细胞表面相互结合，介导出生化串联反应，活化细胞内的JAK2
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STATs、MAPK和PI3K
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GSK3等多条明确的信号通路，从而维持细胞的增殖和分化。胰岛素样生长因
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1(IGF
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1)与生长激素受体组合表达，参与细胞的生长和再生。众所周知，生长激素是在正常人体的脑垂体中产生的，并逐渐增加到青春期，并随着年龄逐渐减少。
[0003]生长激素最主要的生理作用是通过促进身体各组织、器官以及骨骼中受体细胞的蛋白质合成和脂肪的分解，进而促进人的代谢和生长发育。如果人体的生长激素分泌不足，通俗的说就是会导致“发育不良”。因此，目前临床上，生长激素主要被用于治疗儿童生长迟缓和成人的生长激素不足。此外，近年来在美容和抗衰老以及重度烧伤等方面也有了应用，经实验证实生长激素确实能够使体内脂肪重新分泌，会让皮下弹性组织中的粘多糖增加，使皮肤变得坚实有弹性。
[0004]2019年国内生长激素存量市场约55亿元，处于快速增长期。根据出厂口径计算，生长激素市场规模逐年升高，从2014年11.90亿元逐渐增长到2019年55.19亿，复合增长率35.91％。目前国内外重组人生长激素已有多个产品上市，例如辉瑞的健豪宁(注射用重组人生长激素)其适应症为：由内源性生长激素分泌不足所致或由Turner's综合征或慢性肾功能不全引起的生长障碍；Genentech的NUTROPIN；诺和诺德的(somatropin，生长激素)，金赛药业的赛增(重组人生长激素注射液)以及安科生物的安苏萌(注射用重组人生长激素)等。
[0005]然而，这些用药多为短效产品，在临床应用时，由于生长激素在人体内半衰期很短，半衰期大约2小时，所以治疗用药需要皮下注射每天一针，而且给药周期长(例如可高达约6个月以上)。频繁的注射生长激素会给患者带来不便，用药成本也比较昂贵。而市场开发的长效的PEG(聚乙二醇)化生长激素通过聚乙二醇修饰后虽然能够明显提高药物半衰期使其长效化，但由于PEG作为人体内异物有潜在风险，在注射的过程中可能引起疼痛感，安全性收到限制，而且PEG化生长激素的代谢途经肾小球滤过清除，有研究表明PEG成分与肾小管上皮细胞空心化有关，存在潜在隐患。
[0006]目前研究最热，发展最迅速的长效蛋白药物技术为Fc融合蛋白技术，Fc片段是IgG保持体内较长半衰期的主要因素，同时可以稳定蛋白，现已用于多种融合蛋白的开发。Fc片
段通过两种机制发挥功能，第一种是与细胞表面的Fc受体结合，通过吞噬或裂解作用杀伤细胞并通过抗体依赖性细胞毒(ADCC)途径消化病原体。在四种人IgG亚型中IgG1与IgG3能有效的结合细胞表面的Fc受体，而IgG2和IgG4与受体结合的亲和力较低。第二种是与第一补体成分C1的C1q结合，通过补体依赖的细胞毒(CDC)途径裂解病原体。人IgG1和IgG3能有效的结合C1q从而介导补体级联反应，人IgG2与C1q的结合能力较弱，而人IgG4不与C1q结合。Fc融合蛋白主要是为了增加蛋白药物在体内的半衰期和简化生产工艺降低成本，Fc介导的IgG效应和裂解细胞的功能并不是必要的，甚至会产生副作用。Fc融合蛋白技术不仅如PEG化般增大蛋白药物分子质量降低清除率，更加也能通过FcRn结合域，通过pH敏感性结合力以缓释的方式延长半衰期。这种从基因水平将融合伴侣与效应分子连接在一起，不需要额外的化学修饰，纯化、制备过程简单，质量控制也相对容易，综合来看是非常有前景的一种长效化手段。

技术实现思路

[0007]本专利技术的首要目的在于提供一种重组人生长激素Fc融合蛋白，编码该融合蛋白的核苷酸的载体、宿主细胞及其用途。由本专利技术涉及的融合蛋白，作为药物用于治疗儿童生长迟缓和成人的生长激素不足以及重度烧伤等方面，能延长血清半衰期，降低治疗时间内所需的注射给药频率，提高患者的依从性和医患双方的便利性。
[0008]本专利技术提供了一种长效重组人生长激素Fc融合蛋白，所述融合蛋白优选由N端至C端依次为：人生长激素、连接肽、Fc片段(简称rGH
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Fc)，次优选为Fc片段、连接肽、人生长激素(简称Fc
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rGH)。
[0009]其中生长激素的氨基酸序列同GenBank:M13438.1中的氨基酸序列，共191个氨基酸。
[0010]进一步地，优选的柔性肽接头氨基酸组成的结构通式为(GGGGS)nA，其中n是大于或等于2的整数，在一些实施例，n＝3，在另一些实施例中，n＝2或4。
[0011]n在保护范围内的取值并不影响具体实施例的构建，进行和试验结果。
[0012]在一些实施例中，所述人IgG的Fc变体(残基的编号是依据Kabat Eu Index编号)选自下组：
[0013]1)至少含有以下两个突变的IgG1 Fc：Leu234Ala，Leu235Ala，Asn297Ala，Val308Pro以及删除C末端Lys，所述IgG1 Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
[0014]2)至少含有以下两个突变的IgG2 Fc：Asn297Ala，Val308Pro，Pro331Ser以及删除C末端Lys，所述IgG2 Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；
[0015]3)至少含有以下两个突变的IgG4 Fc：至少含有Ser228Pro，Glu233Pro，Leu234Ala或者Leu234Val，Leu235Ala，Asn297Ala，Val308Pro和Arg409Lys以及删除C末端Lys的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域，所述IgG4 Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；
[0016]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0017]首先确定重组人生长激素Fc融合蛋白的氨基酸序列，在两端加入合适的酶切位
点、Koaza序列和引导分泌的信号肽，参考了如中国仓鼠蛋白翻译各密码子利用率的网站或数据库，也参考了一些文献资料在不改变氨基酸序列前提下进行基因编码区密码子优化后本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组人生长激素Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由人生长激素、连接肽和Fc片段组成，所述融合蛋白由N端至C端依次为：人生长激素、连接肽、Fc片段，或者所述融合蛋白由N端至C端依次为Fc片段、连接肽、人生长激素。2.一种根据权利要求1所述的重组人生长激素Fc融合蛋白，其特征在于，所述编码人生长激素基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.一种根据权利要求1所述的重组人生长激素Fc融合蛋白，其特征在于，所述连接肽为柔性连接肽，所述柔性肽接头氨基酸组成的结构通式为(GGGGS)nA，其中n是大于或等于2的整数。4.一种根据权利要求1所述的重组人生长激素Fc融合蛋白，其特征在于，所述Fc片段为人IgG Fc变体。5.一种根据权利要求4所述的重组人生长激素Fc融合蛋白，其特征在于，所述的人IgG Fc变体选自以下一组或多组：1)至少含有以下两个突变的IgG1 Fc：Leu234Ala，Leu235Ala，Asn297Ala，Val308Pro以及删除C末端Lys，所述IgG1 Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；2)至少含有以下两个突变的IgG2 Fc：Asn297Ala，Val308Pro，Pro331Ser以及删除C末端Lys，所述IgG2 Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；3)至少含有以下两个突变的IgG4 Fc：至少含有Ser228Pro，Glu233Pro，Leu234Ala或者Leu234Val，Leu235Ala，Asn297Ala，Val308Pro和Arg409Lys以及删除C末端Lys的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域，所述IgG4 Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。6.一种多核苷酸，其特征在于，编码权利要求1
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5任一权利要求所述的重组人生长激素Fc融合蛋白的氨基酸。7.一种载体或载体组，其特征在于，包含权利要求6所述的多核苷酸。8.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求7所述的载体或载体组，所述宿主细胞是原核的或真核的，为酵母细胞、哺乳动物细胞或适用...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐婷，杨文静，许文娟，黄伟，叶洪涛，崔智强，范清林，宋礼华，
申请(专利权)人：安徽安科生物工程集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：