本发明专利技术的目的是提供一种牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗，即采用生物技术对牙鲆弹状病毒G蛋白进行抗原表位分析、设计，获得一种牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG，并以该融合蛋白作为抗原来制备牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗。本发明专利技术中牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；其中一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2。本发明专利技术利用毕赤酵母系统构建了能表达牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG的基因工程菌。将重组表达的蛋白纯化后制备成基因工程亚单位疫苗，可使免疫后牙鲆获得免疫保护。得免疫保护。
【技术实现步骤摘要】
一种牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗
[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗。
技术介绍
[0002]牙鲆弹状病毒(Hirame rhabdovirus，HIRRV)为单股负链RNA病毒，是弹状病毒科粒外弹状病毒属新成员。HIRRV病毒粒子呈子弹状，长160～180nm，宽60～80nm。HIRRV基因组大小约11000bp，基因组含有6个开放阅读框(ORFs)，分别编码6种蛋白：核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、糖蛋白、依赖RNA的RNA酶和非结构蛋白。其中，糖蛋白(G蛋白)是HIRRV的主要抗原，能够诱导机体产生中和抗体，同时也能够刺激细胞免疫，因此可以选择G基因作为抗原基因来构建基因工程亚单位疫苗。
[0003]HIRRV最早于1986年在日本兵库县的患病牙鲆和香鱼鱼苗中分离获得，主要感染海水鱼类。2012年以后发现HIRRV也能感染淡水鱼类。感染鱼具有鳍、肌肉组织及内部器官出血，造血器官坏死等症状。HIRRV给全球水产养殖业造成了严重的经济损失，目前尚无商业化的牙鲆弹状病毒疫苗进行防控。G蛋白是牙鲆弹状病毒的主要抗原，可以作为亚单位疫苗和DNA疫苗的候选蛋白。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的是提供一种牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗，即通过生物软件预测分析牙鲆弹状病毒G蛋白的主要抗原表位，通过引入通用T细胞表位，并去掉N端信号肽区域与C端影响蛋白表达的强疏水区域，获得一个新型融合蛋白rG，并以该蛋白作为抗原来制备牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗。
[0005]本专利技术首先提供一种牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；
[0006]上述蛋白的一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
[0007]本专利技术还提供一种牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗，其中的抗原为上述的牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG，其浓度为40～50μg/ml之间；
[0008]本专利技术的牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗，其制备步骤如下：
[0009]1)选用毕赤酵母偏好密码子，合成牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG基因序列，连入重组酵母表达载体中，构建成表达重组质粒；
[0010]2)将构建的表达重组质粒电转化宿主酵母菌，构建能表达牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG的重组基因工程酵母菌；用该基因工程菌高密度发酵表达出牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG；
[0011]3)对重组表达的牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG进行纯化后，加入白油佐剂制成疫苗。
[0012]本专利技术利用基因工程技术构建了能表达一种牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG的重组酵母菌株。将重组蛋白纯化后制备成基因工程亚单位疫苗，免疫牙鲆，可使其获得对牙鲆
弹状病毒强毒的免疫保护。
具体实施方式
[0013]下面结合具体实施方式来进一步描述本专利技术，但本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的技术方案的情况下可以对本专利技术的技术方案的细节和形式进行修改或替换，这些修改和替换均落入本专利技术保护范围内。
[0014]实施例1牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG基因的获得
[0015]利用生物软件DNAStar对牙鲆弹状病毒G蛋白(GenBank登录号：AB103462)进行抗原表位分析，去掉N端20个氨基酸的信号肽，C端168个氨基酸组成的影响蛋白重组表达的强疏水区域，并在N端42位氨基酸后面引入一个通用的增强免疫功能的T细胞表位(TAKSKKFPSYTATYQF)，获得一种新型融合蛋白rG，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，并利用在线生物软件http://www.jcat.de/进行毕赤酵母稀有密码子优化，获得融合蛋白rG的核苷酸序列SEQ ID NO:2。
[0016]将新获得的融合蛋白rG的核苷酸序列进行全基因合成，同时两端分别加上XhoI和XbaI酶切位点。
[0017]实施例2基因工程蛋白表达载体的构建与工程菌的获得
[0018]1、将含牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG基因的载体和酵母表达载体均用XhoI和XbaI双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定、测序。
[0019]2、阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中。电转化后均匀涂布于含100μg/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30℃孵育3
‑
5天。待YPDS平板上的阳性转化子生长较大时，将各转化子依次点种至含Zeocin 200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株。
[0020]3、将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100μg/mL Zeocin的YPD培养液中，28℃振摇培养18个小时。取此菌液按4％体积比转接于5ml BMGY培养基中，28℃摇振培养18
‑
24h左右。培养物直接转接于25ml BMMY培养基中，28℃继续摇振培养。为了维持诱导表达，每隔24h补加100％甲醇使终浓度达1％。48h后，4℃5000r/min离心10min，收集上清，进行SDS
‑
PAGE电泳，同时设立未转化的菌液作为对照。结果阳性克隆比对照菌在37kD处多出一条蛋白条带，与重组蛋白理论分子量一致。经牙鲆弹状病毒抗体免疫印迹检定，显示阳性反应。证明获得的阳性克隆为高效表达基因工程蛋白的工程菌。
[0021]实施例3牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗的制备
[0022]1、重组菌发酵
[0023]1)将筛选得到的阳性重组子活化后按1％
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10％接种量接种于三角瓶，28
‑
30℃，200r/min摇床培养16
‑
24h后以5％
‑
20％接种量接入10L发酵罐(实装培养基6L)，温度28
‑
30℃，转速500
‑
1500r/min，培养基pH值5.0
‑
6.0，通气量0.1
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1.0VVM(1L发酵液1min通入的氧气量)，溶氧>20％情况下进行发酵，在培养18
‑
24h后流加50％甘油4h，待溶氧突然升至100％时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48
‑
72h。
[0024]2)发酵结束后，5000r/min离心10min，收集发酵上清即为牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG半成品。
[0025]2、蛋白纯化
[0026]镍柱纯化，咪唑洗脱。将收集的重组蛋白洗脱液放入透析袋，PBS液作为透析外液，透析脱盐后即得重组蛋白液。用BCA法检测蛋白浓度，稀释至终浓度0.15mg/ml，无菌过滤，待用。
[0027]3、重组蛋白灭活
[0028]将纯化的蛋白液中按比例加入10％的甲醛溶液，甲醛溶液的最终浓度为0.2％，37℃灭活12小时，以灭活残存的大肠杆菌。
[00本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG基因，其特征在于，所述的基因的编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。2.如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。3.权利要求1所述的牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG在制备疫苗中的应用。4.一种牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗的抗原为权利要求1所述的牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG。5.如权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗中牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG的浓度为40
【专利技术属性】
技术研发人员：侯竹美，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：
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