杀伤、分泌、抗耗竭、CD4比例提高的甲基化重编程CART细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及细胞工程领域，公开了杀伤、分泌、抗耗竭、CD4比例提高的甲基化重编程CAR T细胞及其制备方法和应用，该方法包括将CAR T细胞在DNA去甲基化药物的存在下进行培养，或者表达CAR的慢病毒表达载体在DNA去甲基化药物的存在下感染T细胞。此方法修饰过的CAR T细胞，在12小时内迅速展示出强大的杀伤能力，尤其在超低效靶比的情况下(E:T＝1:30)，dCART相比于普通CART，体现出显著的杀伤能力、增强细胞因子分泌以及扩增水平，临床安全性好，整体抗肿瘤效果可观、并在体内具有持续抗肿瘤能力，具有巨大的临床应用价值。具有巨大的临床应用价值。具有巨大的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
杀伤、分泌、抗耗竭、CD4比例提高的甲基化重编程CAR T细胞及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及细胞工程领域，具体地，涉及一种杀伤、分泌、抗耗竭、CD4/CD8比例提高的CAR T细胞(甲基化重编程CAR T细胞)的制备方法，该方法制备的甲基化重编程CAR T细胞，以该细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的应用。

技术介绍

[0002]CAR-T，嵌合抗原受体T细胞，是目前较为有效的恶性肿瘤的治疗方式之一。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。
[0003]目前CAR T细胞治疗血液系统肿瘤已经获得了非常好的疗效，在B细胞白血病中，有80％以上患者获得完全缓解；在B细胞淋巴瘤患者中，50％以上的患者会获得完全缓解。随着CAR T细胞的应用，高缓解率的同时也暴露出一些问题。例如，40％完全缓解的患者会在一年内复发，而且复发的患者再次对CAR T细胞治疗无反应；另外依然有20-50％的患者对CAR T细胞治疗反应无应，这些关键CAR T治疗出现的新的临床问题需要解决。
专利技术内容
[0004]本专利技术的目的是将CAR T细胞在化学药物的作用下重编程，提供一种提高杀伤能力、细胞因子分泌能力、抗耗竭能力以及CD4比例的甲基化重编程CAR T细胞(简称D-CAR T细胞)的制备方法，该方法制备的D-CAR T细胞具有提高的细胞因子分泌能力、抗耗竭能力以及CD4/CD8比例，对肿瘤细胞具有更高的杀伤力。
[0005]本专利技术的专利技术人发现，改善CAR T细胞基因组成分从而阻断或削弱CAR T细胞耗竭的细胞通路、提高CD4/CD8细胞比率、提高细胞因子分泌能力、增强T细胞活化、增殖及杀伤细胞通路可能是有效延长CAR T体内作用时间，降低疾病复发的有效手段。因此，需要开发一种制备更强效杀伤能力、在体内持久性能力强、CD4/CD8细胞比率高、抗耗竭的CAR T细胞的方法。而本专利技术的专利技术人在研究中进一步发现，低剂量DNA去甲基化药物能够重编程CAR T细胞，提高CAR T细胞的杀伤能力、细胞因子分泌能力、抗耗竭能力和CD4/CD8比例，尤其是在极低效靶比的情况下，D-CAR T细胞依然保持高效的杀伤能力，耗竭程度低于普通CAR T，从而使得D-CAR T细胞能够更有效发挥在体内的抗肿瘤作用。
[0006]因此，为了实现上述目的，第一方面，本专利技术提供一种甲基化重编程CAR T细胞的制备方法，该方法包括将CAR T细胞在DNA去甲基化药物的存在下进行培养，或者表达CAR的慢病毒表达载体在DNA去甲基化药物的存在下感染T细胞，得到甲基化重编程CAR T细胞，所
述甲基化重编程CAR T细胞具有提高的杀伤能力、细胞因子分泌能力、抗耗竭能力和CD4/CD8比例。
[0007]第二方面，本专利技术提供了由如上所述的方法制得的D-CAR T细胞。
[0008]第三方面，本专利技术提供了如上所述的D-CAR T细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的应用。
[0009]第四方面，本专利技术提供了DNA去甲基化药物在制备甲基化重编程CAR T细胞中的应用，所述甲基化重编程CAR T细胞具有提高的杀伤能力、细胞因子分泌能力、抗耗竭能力和CD4/CD8比例。
[0010]本专利技术通过使用DNA去甲基化药物对CAR T细胞重编程，在不影响相应CAR表达的情况下，能够显著提高CAR T细胞中CD4/CD8的比例；且对靶细胞具有更高效、快速的杀伤能力，尤其在超低效靶比的情况下；与靶细胞接触后，其细胞因子(例如，TNF-α、IL-2、IFN-γ)的分泌量显著增加，且对肿瘤细胞的杀伤活性明显增强，此外，通过基因组学分析显示，重编程后的CAR T细胞，阻断或削弱了CAR T细胞耗竭的细胞通路，增强T细胞活化、增殖及杀伤细胞通路。本专利技术提供的D-CAR T细胞临床安全性好，无毒副作用，整体抗肿瘤效果可观，具有巨大的临床应用价值。具体的，
[0011]1)如实施例2所示的，DNA去甲基化药物基本不影响CAR19 T细胞中CAR的表达；
[0012]2)如实施例3所示的，显著提高了CAR19 T细胞中CD4/CD8的比例，且接近于1；
[0013]3)如实施例4所示的，在0.2:1的效靶比下，20小时内杀伤83％的靶细胞，明显高于未使用DNA去甲基化药物处理的CAR19 T细胞及NT组；
[0014]4)如实施例5所示的，去甲基化药物增强型CAR19 T细胞分泌细胞因子的能力明显高于普通型CAR19 T细胞；
[0015]5)如实施例6所示的，在超低效靶比的情况下(E:T＝1:30)，本专利技术提供的D-CAR19 T细胞，在12小时内即迅速展示出强大的杀伤能力，相比于普通CAR19 T，体现出显著的杀伤能力，96小时杀伤效率能够达到90％以上；
[0016]6)如实施例7所示的，采用本专利技术的方法得到的D-CAR19 T的记忆表型细胞增加，说明本专利技术提供的方法制备的D-CAR T对靶细胞具有更高效、快速的杀伤能力；
[0017]7)如实施例8所示的，通过基因组学分析显示，重编程后的CAR19 T细胞，阻断或削弱了CAR19 T细胞耗竭的细胞通路，增强T细胞活化、增殖及杀伤细胞通路。
[0018]本专利技术的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
[0019]附图是用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本专利技术，但并不构成对本专利技术的限制。在附图中：
[0020]图1为DNA去甲基化药物处理后的CAR19 T细胞(图1-1)与未处理的CAR19 T细胞(图1-2)中CAR19表达效果；
[0021]图2为DNA去甲基化药物处理后的CAR19 T细胞中CD4/CD8比例提高情况；
[0022]图3为DNA去甲基化药物处理后的CAR19 T细胞在效靶比0.2:1的条件下对CD19阳性的Raji细胞的杀伤效果；
[0023]图4为DNA去甲基化药物处理后的CAR19 T细胞在效靶比1:1的条件下接触24小时
后，培养上清中细胞因子(IL-2(图4-1)、IFN-γ(图4-2)、TNF-α(图4-3))的分泌情况；
[0024]图5为超低效靶比的情况下(E:T＝1:30)本专利技术方法制备的D-CAR T细胞对Naml6细胞的杀伤情况；
[0025]图6为本专利技术的方法得到的D-CAR T细胞的记忆表型细胞量；
[0026]图7为本专利技术的方法得到本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甲基化重编程CAR T细胞的制备方法，其特征在于，该方法包括将CAR T细胞在DNA去甲基化药物的存在下进行培养，或者表达CAR的慢病毒表达载体在DNA去甲基化药物的存在下感染T细胞，得到甲基化重编程CAR T细胞，所述甲基化重编程CAR T细胞具有提高的杀伤能力、细胞因子分泌能力、抗耗竭能力和CD4/CD8比例。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述DNA去甲基化药物在CAR T细胞培养的第1-7天加入。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述CAR T细胞在DNA去甲基化药物的存在下培养24-72小时；优选的，表达CAR的慢病毒表达载体在DNA去甲基化药物的存在下感染T细胞之后，并在DNA去甲基化药物的存在下培养24-72小时。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述DNA去甲基化药物在细胞培养基中的浓度为10-1000nM。5.根据权利要求1-4中任意...

【专利技术属性】
技术研发人员：王瑶，韩为东，伍志强，佟川，韩笑，郭业磊，代汉仁，刘洋，遆冬冬，王晓慧，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：