一种在活化的T细胞中具有高活性的启动子制造技术

本发明专利技术提供在活化的T细胞中具有高活性的启动子，其从5

【技术实现步骤摘要】
一种在活化的T细胞中具有高活性的启动子


[0001]本专利技术涉及一种在活化的T细胞中具有高活性的启动子。

技术介绍

[0002]启动子是基因的一个组成部分，通常位于结构基因5
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端上游，是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一，选择高效率的启动子是高效率表达外源基因的关键。
[0003]根据启动子的转录模式可将其分为3类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。
[0004]组成型启动子是指在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异，因而称之为组成型启动子。哺乳动物中常用的组成型启动子包括病毒来源：鼠或人巨细胞病毒(CMV)启动子(分别简称mCMV与hCMV)、猴空泡病毒SV40启动子；人基因组天然来源：EF1α启动子、泛素启动子(Ubiquitin，简称Ubi)、β-actin启动子、PGK-1启动子、Rosa26启动子、HSP70启动子、GAPDH启动子、eIF4A1启动子、Egr1启动子、FerH启动子、SM22α启动子、Endothelin-1启动子等。
[0005]在肿瘤免疫治疗中，维持外源基因的高效稳定表达非常重要。然而，一些病毒来源的组成型启动子尽管瞬时表达活性较高(如CMV启动子)，但容易因表观遗传修饰而被关闭表达；而一些人源天然组成型启动子或肿瘤特异性启动子虽然表达稳定，但表达活性相对较弱，难以满足免疫治疗需求。因而，研究人员又设计构建了一系列人工嵌合启动子，它们包含了一些顺式调控元件，主要包括能发挥稳定表达作用的启动子核心序列，以及能增强表达效率的上游增强子或下游内含子，代表者是嵌合启动子CAG(包含人CMV增强子-鸡β-actin启动子-兔β-globin内含子)，广泛应用于外源基因的表达。
[0006]增强子指增加同它连锁的基因转录频率的DNA序列，增强子通过启动子来增加下游基因的转录。有效的增强子可以位于基因的5
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端，也可位于基因的3
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端，有的还可位于基因的内含子中。增强子的效应很明显，一般能使基因转录频率增加10-200倍，有的甚至可以高达上千倍。

技术实现思路

[0007]本专利技术构建了一种以CMV增强子、IFNγ启动子和HTLV(人T细胞白血病病毒)的长末端重复(LTR)序列组合而成的启动子，该启动子表现出在活化的免疫细胞中比现有启动子更强的活性，而在其他非免疫细胞中活性低或无活性。
[0008]因此，本专利技术提供一种启动子，从5
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端到3
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端其包含依次连接的CMV增强子、IFNγ启动子和人T细胞白血病病毒的长末端重复序列。
[0009]在一个或多个实施方案中，所述CMV增强子选自：具有SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的CMV增强子，或来自人CMV的与SEQ ID NO:8所示核苷酸序列具有至少97％序列同一性的CMV增强子。
[0010]在一个或多个实施方案中，所述IFNγ启动子选自：具有SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的IFNγ启动子，或来自人的与SEQ ID NO:4所示核苷酸序列具有至少97％序列同一性的IFNγ启动子。
[0011]在一个或多个实施方案中，所述人T细胞白血病病毒的长末端重复序列选自：具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的长末端重复序列，或来自人T细胞白血病病毒的与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列具有至少97％序列同一性的长末端重复序列。
[0012]本专利技术还提供一种核酸构建物，其含有本专利技术所述的启动子和与该启动子操作性连接的感兴趣的基因。
[0013]在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是一表达框。
[0014]在一个或多个实施方案中，所述感兴趣的基因编码自分泌抗体，优选为免疫检查点抗体，如PD-1抗体、CTLA4抗体、PD-L1抗体、LAG-3抗体、TIM-3抗体、TIGIT抗体和VISTA抗体，更优选为来源于羊驼的纳米抗体。
[0015]本专利技术还提供一种载体，其含有本专利技术所述的启动子或核酸构建物。
[0016]在一个或多个实施方案中，所述载体为表达载体或克隆载体。
[0017]还提供的是一种宿主细胞，其含有本文所述的启动子、核酸构建物或载体。
[0018]在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为免疫细胞，优选为T细胞，其基因组中整合有本文任一实施方案所述的核酸构建物；优选地，所述免疫细胞还表达CAR或含有CAR的表达载体。
[0019]还提供的是本专利技术所述的启动子在提高感兴趣的基因在活化的免疫细胞中的表达中的应用，或在制备用于在活化的免疫细胞中增强表达的核酸构建物或载体中的应用。
附图说明
[0020]图1：pS338B-EGFP质粒图谱。
[0021]图2：pS-IFPT-EGFP质粒图谱。
[0022]图3：pS-IL3en-EGFP质粒图谱。
[0023]图4：pS-uIFP-EGFP质粒图谱。
[0024]图5：pS-uIFPT-EGFP质粒图谱。
[0025]图6：pS-CIFT-EGFP质粒图谱。
[0026]图7：pS-ILFP-EGFP质粒图谱。
[0027]图8：pS-ILPT-EGFP质粒图谱。
[0028]图9：pS-uILP-EGFP质粒图谱。
[0029]图10：pS-uILT-EGFP质粒图谱。
[0030]图11：pS-CILT-EGFP质粒图谱。
[0031]图12：pS-ILFP-EGFP质粒图谱。
[0032]图13：pS-IFen-EGFP质粒图谱。
[0033]图14：pS-uIFen-EGFP质粒图谱。
[0034]图15：pS-CIFen-EGFP质粒图谱。
[0035]图16：pS-LIFen-EGFP质粒图谱。
[0036]图17：pS338B-Fluc质粒图谱。
[0037]图18：pS-IFPT-Fluc质粒图谱。
[0038]图19：pS-CIFT-Fluc质粒图谱。
[0039]图20：pS-ILFP-Fluc质粒图谱。
[0040]图21：pS-ILPT-Fluc质粒图谱。
[0041]图22：pS-CILT-Fluc质粒图谱。
[0042]图23：pS338B-αPD1质粒图谱。
[0043]图24：pS-CIFT-αPD1质粒图谱。
[0044]图25：IFN-γ基因启动子和IL2基因启动子对嵌合基因启动子活性影响的比较。
[0045]图26：TLTR和IFN-γ内含子增强子对嵌合基因启动子活性影响的比较。
[0046]图27：不同活化方式对两种质粒eGFP表达的影响。
[0047]图28：双荧光素酶报告系统检测结果。
[0048]图29：细胞因子基因嵌合启动本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种启动子，从5
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端到3
’
端包含依次连接的CMV增强子、IFNγ启动子和人T细胞白血病病毒的长末端重复序列。2.如权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述CMV增强子选自：具有SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的CMV增强子，或来自人CMV的与SEQ ID NO:8所示核苷酸序列具有至少97％序列同一性的CMV增强子；和/或所述IFNγ启动子选自：具有SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的IFNγ启动子，或来自人的与SEQ ID NO:4所示核苷酸序列具有至少97％序列同一性的IFNγ启动子；和/或所述人T细胞白血病病毒的长末端重复序列选自：具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的长末端重复序列，或来自人T细胞白血病病毒的与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列具有至少97％序列同一性的长末端重复序列。3.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物含有权利要求1-2中任一项所述的启动子和与该启动子操作性连接的感兴趣的基因。4.如权利要求3所述的核酸构建物，其特征在于，所述感兴趣的基因编...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘韬，方媛，高海霞，
申请(专利权)人：上海细胞治疗集团有限公司，
类型：发明
国别省市：