一种可追踪细胞分化发育的双重诱导mCreER系统及其建立与应用技术方案

本发明专利技术涉及一种可追踪细胞分化发育的双重诱导mCreER系统，包括mCreER和mTEVp蛋白；mCreER和mTEVp蛋白分别通过FRB蛋白、FKBP蛋白与定位于细胞膜上的CD8连接，相对应固定在细胞膜上；当加入雷帕霉素时，FKBP蛋白与FRB蛋白相互靠近并结合形成复合体，诱导mTEVp蛋白的切割，使mCreER从质膜释放，并在他莫昔芬作用下入核介导loxP位点重组，实现重组时间的可控性。本发明专利技术的双重诱导mCreER系统只有在诱导的条件下，Cre重组酶才能进入到细胞核中进行重组，避免了传统CreER系统自发重组现象。mCreER是膜蛋白，相对表达量比较低，经诱导进入细胞核后，能够减少Cre重组酶的脱靶现象，降低细胞毒性，提高组织特异性；实现对组织细胞更严密和精确的追踪，为细胞发育、组织再生及疾病治疗提供新思路。疗提供新思路。疗提供新思路。

【技术实现步骤摘要】
一种可追踪细胞分化发育的双重诱导mCreER系统及其建立与应用


[0001]本专利技术涉及细胞谱系示踪技术，尤其涉及一种可追踪细胞分化发育的双重诱导mCreER系统及其建立与应用。

技术介绍

[0002]细胞谱系示踪是指利用不同方法标记细胞，追踪观察其后代所有细胞的增殖、迁移和分化活动，为研究组织细胞发育、单细胞分化和疾病发生过程提供重要手段。追踪细胞的起源和特性，有助于更好地了解发病机制，为疾病治疗提供新的见解。细胞谱系示踪技术主要包括直接观察法，染色标记靶细胞法，细胞和组织的移植标记法，遗传镶嵌法和CreER
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Loxp系统标记法等。与传统的示踪手段相比，CreER
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loxP系统标记具有良好的靶向性，又有时间的可控性，能够在特定的时间追踪所标记细胞的分化发育，已成为细胞谱系示踪技术有力工具。
[0003]条件性CreER
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loxP系统存在不可忽略的自发性重组现象。条件性细胞谱系追踪系统CreER
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loxP的工作原理是，将Cre与雌激素受体(ER)的配体结构域相融合，Cre蛋白原本定位于细胞核，与ER融合后可与伴侣蛋白HSP90结合，因此，CreER被锚定在胞浆。在雌激素或其替代物他莫昔芬诱导下，CreER发生构象改变，与HSP90解离，从胞浆进入胞核，并介导loxP位点特异性重组。通过不断改造，目前采用的CreER对内源雌激素不敏感，只与他莫昔芬起反应。然而，近来的研究发现，条件性CreER
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loxP系统存在不可忽略的自发重组即泄漏现象(在没有诱导的条件下，发生的重组)。例如，将CreER基因插入ROSA26位点(ROSA26
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CreER)，在没有加入诱导剂的条件下，转CreER基因小鼠多处组织的Cre靶点发生散发性的自发重组。通过胰岛素启动子(RIP)控制CreER在胰岛Beta细胞特异性表达(RIP
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CreER)，在成年小鼠胰岛发生的自发重组比例高达40
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70％。将CreER基因敲入(Knockin)胰高血糖素(GCG)基因启动子下游(GCG
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CreER)，实现胰岛Alpha细胞特异性标记，然而，6％左右的Alpha细胞标记是自发的。在两种胆管细胞特异性CreER表达品系小鼠(Opn
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iCreER)和Ck19
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CreER)，自发重组率分别达到约2％和13％。软骨细胞特异性CreER表达品系小鼠(Col2a1
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creER和UBC
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creER)同样具有显著的泄露现象。因此，无论是由组织特异性启动子或非特异性启动子控制，也不论是基因组异位表达还是基因敲入(Knockin)由内源启动子控制，CreER蛋白都存在普遍的不可忽略的泄露现象，其根本原因在于HSP90与CreER的结合是动态的，总有一些CreER脱离HSP90的控制；再者，核膜在细胞分裂时发生解体，消除了核与胞浆间的隔阂，CreER也就获得了与loxP位点相接触的机会。自发重组，造成非靶标细胞提前被标记，严重影响精确追踪。除了自发重组，Cre或CreER在细胞核内长时间停留，就有可能与隐性靶位点结合，造成基因组损伤进而产生细胞毒性，从而影响实验结果的分析与判断。
[0004]尽管CreER
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loxP追踪系统在研究个体与组织发育领域起着不可替代的作用，但是它本身也存在一些技术瓶颈。该技术主要依赖的Cre重组酶存在自发性泄露、异位表达及细
胞毒性问题，使追踪结果可靠性大大降低，而这也成为近年来很多科学问题产生争议的主要原因之一。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种可追踪细胞分化发育的双重诱导mCreER系统及其建立与应用，解决现有技术存在的问题。
[0006]为了实现上述的目的，采用如下的技术方案：
[0007]一种可追踪细胞分化发育的双重诱导mCreER系统，包括mCreER和mTEVp蛋白；所述mCreER和mTEVp蛋白分别通过FRB蛋白、FKBP蛋白与定位于细胞膜上的CD8连接；所述mCreER和mTEVp蛋白相对应固定在细胞膜上；当加入诱导剂雷帕霉素时，FKBP蛋白与FRB蛋白相互靠近并结合形成复合体，诱导mTEVp蛋白的切割，使mCreER从质膜释放，并在诱导剂他莫昔芬作用下入核介导loxP位点重组，实现重组时间的可控性。
[0008]本专利技术的追踪细胞分化发育的双重诱导mCreER系统中CD8分子是一种白细胞分化抗原，由信号肽、胞外结构域、跨膜蛋白和胞内域四部分组成，定位于细胞膜上。FKBP家族蛋白是一类免疫球蛋白，具PPIase酶(peptidyl
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prolyl isomerase)活性，能够与免疫抑制剂FK506结合，因此命名为FKBP。雷帕霉素(rapamycin)，是一种大环内酯天然产物，能够介导FKBP与mTOR的FRB(FKBP
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rapamycin binding)结构域之间的相互结合作用。当加入诱导剂雷帕霉素时，FKBP蛋白与FRB蛋白相互靠近并结合形成复合体，激活了目的基因，从而实现对靶基因表达的时间调控作用。烟草蚀斑病毒蛋白酶(Tobacco etch virus protease,TEVp)是烟草病毒基因TEVp编码的核包体Nia(Nuclear Inclusion a)蛋白，大小为27kD的蛋白酶，具有很强的位点特异性，能够识别ENLYFQ(G/S)的七个氨基酸序列(CS)。pCMV
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mCreER(pCMV
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CD8
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FRB
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CS
‑
CreER)质粒由CD8，FRB，CS和CreER四个基因相连组成；pCMV
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mTEVp(pCMV
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CD8
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FKBP
‑
TEVp)质粒由CD8，FKBP和TEVp三个基因相连组成。pCMV
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mCreER和pCMV
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mTEVp表达后，CD8将融合蛋白定位在胞膜上，防止泄露，通过雷帕霉素(RAPA)诱导FKBP/FRB二聚化和TEVp蛋白酶(Tobacco Etch Virus Protease)的切割，使CreER从质膜释放，并在他莫昔芬(4TH)作用下入核介导loxP位点重组，实现重组时间的可控性。
[0009]进一步的，所述mCreER的基因序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述mTEV蛋白的基因序列如序列表SEQ ID NO:2所示。
[0010]进一步的，所述mCreER的基因必须编码序列表SEQ ID NO:3所示氨基酸序列；所述mTEVp蛋白的基因必须编码序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列。
[0011]上述可追踪细胞分化发育的双重诱导mCreER系统的构建，包括以下步骤：
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可追踪细胞分化发育的双重诱导mCreER系统，其特征在于，包括mCreER和mTEVp蛋白；所述mCreER和mTEVp蛋白分别通过FRB蛋白、FKBP蛋白与定位于细胞膜上的CD8连接；所述mCreER和mTEVp蛋白相对应固定在细胞膜上；当加入诱导剂雷帕霉素时，FKBP蛋白与FRB蛋白相互靠近并结合形成复合体，诱导mTEVp蛋白的切割，使mCreER从质膜释放，并在诱导剂他莫昔芬作用下入核介导loxP位点重组，实现重组时间的可控性。2.根据权利要求1所述可追踪细胞分化发育的双重诱导mCreER系统，其特征在于，所述mCreER的基因序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述mTEVp蛋白的基因序列如序列表SEQ ID NO:2所示。3.根据权利要求1所述可追踪细胞分化发育的双重诱导mCreER系统，其特征在于，所述mCreER的基因必须编码序列表SEQ ID NO:3所示氨基酸序列；所述mTEVp蛋白的基因必须编码序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列。4.根据权利要求1所述可追踪细胞分化发育的双重诱导mCreER系统的构建，其特征在于，包括以下步骤：(1)pCMV
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mCreER质粒构建：用SmaI和NotI酶对pCMV
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CD8
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EGFP质粒获得载体骨架，酶切PCR扩增获得的CreER和FRB
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CS片段，分别将片段连接到上述载体骨架上，经酶切和测序验证，获得重组子pCMV
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mCreER；(2)pCMV
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mCreER
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EGFP质粒构建：用EcoRI和SacII酶对pCMV
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CD8
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EGFP质粒获得载体骨架，酶切PCR扩增获得的FRB
‑
CS
‑
CreER片段，将片段连接到上述载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏炽炬，陈勉乔，田雄，
申请(专利权)人：汕头大学，
类型：发明
国别省市：