Expi293细胞瞬时表达目标蛋白的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种Expi293细胞瞬时表达目标蛋白的方法及其应用。本发明专利技术提供的Expi293细胞瞬时表达目标蛋白的方法，培养基培养转染目标DNA后的Expi293细胞的步骤包括降温处理。通过采用该操作能将目标蛋白的表达量和活性大幅度提高，克服了现有技术转染效率低和表达量低的缺点。克服了现有技术转染效率低和表达量低的缺点。

【技术实现步骤摘要】
Expi293细胞瞬时表达目标蛋白的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种Expi293细胞瞬时表达目标蛋白的方法及其应用。

技术介绍

[0002]生产高达毫克或克级的重组蛋白是许多科研团队和制药公司临床前、生化、生物物理和药物研究的基本过程。目前，已经存在多种可以生产重组蛋白的表达体系，包括大肠杆菌表达体系、真核酵母表达体系、杆状病毒介导昆虫细胞表达体系和哺乳动物表达体系。大肠杆菌表达体系操作简单，培养成本低，并且能够快速产生高水平的重组蛋白，但存在重组蛋白溶解性差或缺乏适当的翻译后修饰的问题。真核酵母表达体系，特别是Pichia pastoris和Saccharomyces cerevisiae，提供了原核宿主(例如大肠杆菌宿主)的替代品和蛋白质翻译后修饰的一些能力，然而，由于技术要求，酵母表达体系在许多实验室中并不流行。杆状病毒-昆虫细胞表达体系具有真核蛋白质合成能力，并提供类似于哺乳动物细胞中观察到的蛋白质折叠、修饰和加工，然后，杆状病毒介导昆虫细胞表达体系的主要缺陷是需要花费大量时间和精力去表达目标蛋白，而且昆虫细胞的蛋白质N-糖基化途径不能产生具有倒数第二个半乳糖和末端唾液酸残基的复杂的二元N-连接的寡糖侧链。与上述三个体系相比，哺乳动物细胞体系生产重组蛋白由于其具有能最佳的表达高分子量的蛋白质产物、使复杂结构的蛋白产生正确的折叠和给糖蛋白提供合适的翻译后修饰的功能而成为生物制药领域的表达重组蛋白的最佳选择。
[0003]传统的哺乳动物细胞表达体系是构建细胞稳定表达的将外源基因整合到宿主细胞染色体上的稳定株表达体系。构建稳定株表达体系生产重组蛋白需要在DNA导入细胞后进行长时间的筛选，然后才能确定表达量高并且稳定的细胞株，这个过程通常需要几个月的时间并且花费大量的人力来完成。
[0004]随着生命科学和生物制药的飞速发展，大量的蛋白被用于基础研究和药物开发，急需一个能在短时间内就能得到重组蛋白的方法。基因瞬时表达应运而生，与稳定株表达体系不同，瞬时转染的外源DNA不整合到宿主细胞DNA中，其在细胞中的数目通常随着细胞的分裂而减少，因此蛋白表达只能维持几天到十几天的时间，但其优点是能在短短几天之内拿到基因的表达产物，而且其通用性强。然而，相对于构建稳定株表达体系来说，瞬时转染生产重组蛋白存在转染效率低、表达量低的缺点，使得此方法的应用受到较大的限制，此外，虽然转染试剂与培养方法等逐渐成熟，然而瞬时转染的成本也较高。因此怎样提高瞬时转染的效率、提高表达量并且降低瞬时转染的成本使之成为日常操作成为亟待解决的问题。
[0005]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一目的在于提供一种Expi293细胞瞬时表达目标蛋白的方法，以缓解
上述技术问题中的至少一个，具体包括缓解现有技术中Expi293细胞瞬时转染表达目标蛋白成本过高的问题。
[0007]本专利技术的第二目的在于提供上述方法在免疫检测中的应用。
[0008]为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：
[0009]一种Expi293细胞瞬时表达目标蛋白的方法，培养转染目标DNA后的Expi293细胞，培养步骤包括降温处理。
[0010]进一步地，培养转染目标DNA后的Expi293细胞的步骤包括：先36-38℃进行培养，第1-3天再降温至32-34℃培养到第4-10天。
[0011]进一步地，所述培养步骤还包括更换培养基重悬处理；
[0012]优选地，培养转染目标DNA后的Expi293细胞的步骤包括：先36-38℃进行培养，第1-3天再降温至30-34℃培养，第3-5天更换培养基，重悬培养至第6-10天；
[0013]优选地，培养转染目标DNA后的Expi293细胞的步骤包括：先37℃进行培养，第2天再降温至33℃培养，第4天更换培养基，重悬培养至第6天。
[0014]进一步地，目标DNA通过转染试剂转染到Expi293细胞中，得到转染目标DNA后的Expi293细胞；
[0015]优选地，所述目标DNA与所述Expi293细胞的比例为(15-30)μg：(2
×
10
7-5
×
107)个。
[0016]进一步地，所述目标DNA与所述转染试剂的质量比为1：(2-4)。
[0017]进一步地，所述目标DNA与所述转染试剂的质量比为1：3。
[0018]进一步地，所述转染试剂包括PEI或脂质体。
[0019]进一步地，所述转染试剂为PEI。
[0020]进一步地，所述培养基包括Dynamis培养基。
[0021]上述的方法在重组蛋白表达中的应用。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0023]本专利技术提供一种Expi293细胞瞬时表达目标蛋白的方法，培养转染目标DNA后的Expi293细胞，培养步骤包括降温处理。专利技术人首次发现细胞的培养工艺参数的不同对目标蛋白的表达量和活性都会产生影响，经研究发现培养过程中降温操作会对Expi293细胞瞬时表达目标蛋白的表达量和活性产生重大的影响，通过采用该操作能将目标蛋白的表达量和活性大幅度提高，克服了现有技术转染效率低和表达量低的缺点。该方法适用于工业生产，更有利于Expi293细胞瞬时转染表达目标蛋白成为日常操作。
具体实施方式
[0024]下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
[0025]除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本专利技术中。
[0026]一种Expi293细胞瞬时表达目标蛋白的方法，培养转染目标DNA后的Expi293细胞，培养步骤包括降温处理。
[0027]专利技术人首次发现细胞的培养工艺参数的不同对目标蛋白的表达量和活性都会产生影响，经研究发现培养过程中降温操作均会对Expi293细胞瞬时表达目标蛋白的表达量和活性产生重大的影响，通过采用该操作均能将目标蛋白的表达量和活性大幅度提高，克服了现有技术转染效率低和表达量低的缺点。该方法适用于工业生产，更有利于Expi293细胞瞬时转染表达目标蛋白成为日常操作。
[0028]需要说明的是，降温处理可以为先常规培养一段时间后再降低培养温度进行培养；本专利技术中的常规培养是指Expi293细胞的一般操作，即37℃连续培养。
[0029]在优选地实施方式中，培养转染目标DNA后的Expi293细胞的步骤包括：先36-38℃进行培养，第1-3天再降温至32-34℃培养到第4-10天。专利技术人通过研究发现，培养温度对目标蛋白的表达量和活性产生影响，经过研究发现，先再36-38℃连续培养，再在第1-3天采取降温至32-34℃本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Expi293细胞瞬时表达目标蛋白的方法，其特征在于，培养转染目标DNA后的Expi293细胞，培养步骤包括降温处理。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，培养转染目标DNA后的Expi293细胞的步骤包括：先36-38℃进行培养，第1-3天再降温至32-34℃培养到第4-10天。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养步骤还包括更换培养基重悬处理；优选地，培养转染目标DNA后的Expi293细胞的步骤包括：先36-38℃进行培养，第1-3天再降温至30-34℃培养，第3-5天更换培养基，重悬培养至第6-10天；优选地，培养转染目标DNA后的Expi293细胞的步骤包括：先37℃进行培养，第2天再降温至33℃培养，第4天更换培养基，重悬培养至第6天。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，目标DNA通过...

【专利技术属性】
技术研发人员：霍永庭，涂晶晶，秦学芳，符俊，翁源灿，
申请(专利权)人：广东菲鹏制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：