一种能稳定表达ABEmax蛋白的细胞株及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种能稳定表达腺嘌呤碱基编辑器(ABEmax)蛋白的细胞株及其制备方法和应用，该方法利用Piggybac系统导入ABEmax蛋白表达基因和抗生素筛选基因到工具细胞293T细胞中，通过抗性筛选到流式筛选阳性单克隆细胞株，最终得到能够稳定表达ABEmax蛋白的细胞株。本发明专利技术构建的细胞株是基于Piggybac转座子构成的载体

【技术实现步骤摘要】
一种能稳定表达ABEmax蛋白的细胞株及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种稳定表达ABEmax基因的工具细胞293T细胞株及其制备方法与应用。属于基因工程领域。

技术介绍

[0002]基因编辑技术是利用人工核酸酶对基因组进行靶向修饰的遗传工程技术，是当今生命科学领域的研究热点。CRISPR/Cas9基因编辑系统虽然提高了基因敲除及定点修饰(包括定点突变及基因插入等)的效率，但是仍然存在一定的不足：同源介导修复(homology
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directed repair,HDR)的低编辑效率。与非同源末端连接(non
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homologous End Joining,NHEJ)相比，HDR以相对低的频率发生，并且在非分裂细胞中，这个修复机制会进一步遭受下调。
[0003]碱基编辑技术(base editing)是基于CRISPR/Cas系统所发展起来的一种新型基因修饰技术，根据碱基修饰酶的不同可分为胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor,CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor,ABE)。这两种碱基编辑系统利用胞嘧啶脱氨酶或人工进化的腺嘌呤脱氨酶对基因的靶位点进行精准的碱基编辑，最终可以分别实现C
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T(G
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A)或A
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G(T
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C)的碱基替换。碱基编辑技术自从被开发以来，因其高效、不依赖DNA双链断裂的产生、无需供体DNA参与等诸多优势，已经成功地应用在多种动物、植物和其他生物中，为基因治疗等领域提供了重要技术支撑。
[0004]由于碱基编辑系统编码基因比较大，整个编辑系统质粒长度超过8000bp，在进行碱基编辑时，可能会因质粒过大影响细胞的转染效率和编辑效率，使得构建基因编辑细胞系的成功率大为下降。因此，开发一种能够稳定表达碱基编辑系统的细胞系具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在解决目前因碱基编辑系统较大影响转染效率和编辑效率的技术问题。为此，本专利技术提出一种能稳定表达ABEmax这种腺嘌呤碱基编辑器的细胞株的制备方法，该方法能够通过PiggyBac转座系统将ABEmax的编码基因插入到工具细胞293T中并稳定表达。
[0006]本专利技术还提出一种使用上述制备方法制备得到的细胞株。
[0007]本专利技术还提出了这种细胞株的应用。
[0008]根据本专利技术实施例的稳定表达ABEmax编辑器的细胞株的制备方法，包括以下步骤：
[0009]S1、设计并构建能表达ABEmax基因、抗生素筛选标记的piggyBac载体；
[0010]S2、将所述piggyBac载体和转座酶基因载体共转入工具细胞293T细胞，通过抗生素筛选阳性细胞株并对筛选出的阳性细胞株进行编辑效果鉴定；
[0011]S3、将所述有编辑效果的细胞株经过抗生素筛选后流式分选单克隆细胞系；
[0012]S4、单克隆细胞经过PCR验证和编辑效果验证后即得稳定表达ABEmax蛋白的细胞
株。
[0013]根据本专利技术的制备方法和最终得到的细胞株，至少具有如下的有益效应：本专利技术结合基因同源重组技术构建包含有ABEmax的PiggyBac转座系统，利用转座酶基因质粒，将外源的ABEmax基因整合到293T基因组中，插入位点为TTAA，但不是AT富含区，有效避免了病毒元件随机整合过程带来的风险；通过将ABEmax蛋白表达系统整合到基因组中，可以大幅提高后续碱基编辑效率；对于遗传疾病的位点突变和修复可以利用本方法建立的细胞系进行模拟突变和基因突变纠正，为单碱基突变的遗传类疾病治疗奠定基础。因此，本专利技术的细胞株在碱基编辑制备目标细胞株领域具有广阔的应用前景。
[0014]根据本专利技术的一些实施例，所述ABEmax基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0015]根据本专利技术的一些实施例，所述抗生素筛选标记为嘌呤霉素抗性基因。
[0016]作为优选地，所述ABEmax基因包括独立的启动子和终止结构，与筛选标记嘌呤霉素抗性基因之间通过T2A元件连接，且ABEmax基因还包括核定位信号NLS。
[0017]根据本专利技术的实施例的应用，至少具有如下有益效果：使用本专利技术的细胞株制备碱基编辑的细胞株步骤简单，由于本细胞株能够稳定表达ABEmax腺嘌呤碱基编辑器，因此，只需要转入相应的sgRNA片段，培养48小时后进行筛选即可。
[0018]本专利技术的附加方面和优点将在下面实施例的描述中给出，或者通过本专利技术的实践了解到。
附图说明
[0019]图1本专利技术实施例中构建ABEmax稳定表达细胞株流程示意图；
[0020]图2本专利技术实施例PiggyBac转座系统中ABEmax蛋白表达载体的具体结构；
[0021]图3本专利技术实施例转座酶质粒的具体结构；
[0022]图4本专利技术实施例细胞转染后嘌呤霉素筛选2天后编辑效果检测；
[0023]图5本专利技术实施例中流式分选293T细胞单细胞图；
[0024]图6本专利技术实施例中流式分选293T细胞单细胞形成单克隆细胞系图；
[0025]图7本专利技术实施例中提取单克隆细胞系基因组进行PCR扩增结果图；
[0026]图8本专利技术实施例中得到的ABEmax稳定表达细胞株碱基编辑效果图。
具体实施方式
[0027]下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。以下结合实施方式并配合附图予以说明。实施例中的生物化学试剂和材料均为常规市售试剂：高保真PCR试剂Phanta Max Super
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Fidelity DNA Polymerase和同源重组试剂盒Mut MultiS Fast Mutagenesis Kit V2购自南京诺唯赞公司；转染试剂Lipo2000和OptiMEM试剂等购自Thermo Fisher；细胞培养血清、DMEM培养基和青
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链双抗和嘌呤霉素等购自Gibco；质粒小提试剂盒购自Axygen。实施例中的技术手段，包括PCR、同源重组、载体构建和细胞实验等也是生物医学领域技术人员的常规手段。
[0028]以下所述为本专利技术的实施例，应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，凡是利用本专利技术说明书和附图内容所做的等同变换，或直接或者间接将本专利技术运用在相关领域，均同理包括在本专利技术的专利保护范围内。
[0029]实施例1：构建PiggyBac转座系统中ABEmax蛋白表达载体
[0030]1.1提取PiggyBac原始质粒
[0031]使用质粒小提试剂盒，按照试剂盒的说明书进行原始PiggyBac和转座酶super piggybac transposase质粒的小量提取。
[0032]1.2 ABEmax蛋白表达系统扩增及构建
[0033]利用高保真PCR试剂扩增ABEmax质粒的工作原件，同时本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种能稳定表达ABEmax蛋白的细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:S1、设计并构建能表达ABEmax基因、抗生素筛选标记的piggyBac载体；S2、将所述piggyBac载体和转座酶基因载体共转入工具细胞293T细胞，通过抗生素筛选阳性细胞株并对筛选出的阳性细胞株进行编辑效果鉴定；S3、将有编辑效果的细胞株经过抗生素筛选后流式分选单克隆细胞系；S4、单克隆细胞经过PCR验证和编辑效果验证后即得稳定表达ABEmax蛋白的细胞株。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗生素筛选标记为嘌呤霉素抗性基...

【专利技术属性】
技术研发人员：马旭，张璐，金孝华，曹小芳，
申请(专利权)人：国家卫生健康委科学技术研究所，
类型：发明
国别省市：