一种启动子及其在棘孢曲霉基因自克隆表达中的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程和微生物改造技术领域，具体提供了一种来源于棘孢曲霉的启动子及其在棘孢曲霉基因自克隆表达中的应用。所述启动子的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示，可显著提高棘孢曲霉内源基因的自克隆表达效率，从而降低棘孢曲霉产酶的生产成本，应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
一种启动子及其在棘孢曲霉基因自克隆表达中的应用
本专利技术属于基因工程与微生物改造
，具体内容涉及一种启动子及其在棘孢曲霉基因自克隆表达中的应用。
技术介绍
基因经过转录、翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子或RNA分子的过程称为基因表达(geneexpression)。基因表达是受内源及外源信号调控的，这个调控的过程称为基因表达调控(generegulationorregulationofgeneexpression)。启动子是基因表达调控的重要顺式作用元件，在基因的表达调控中转录环节是最主要的调控位点，而启动子的调控在转录环节中又占据着十分重要的地位，因此研究启动子的功能序列对于基因调控机制的研究具有十分重要的意义。启动子也是基因工程表达载体的一个重要元件，弄清启动子的分子本质是提高克隆基因表达效率的重要途径。启动子是位于结构基因5’端上游的一段非编码DNA序列，由核苷酸组成，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合并具有转录起始的特异性，是基因转录调控的核心区域。启动子重要组成部分包括许多短的核苷酸序列，即转录因子结合位点，主要分为核心区和上游调控区。真菌的启动子按功能分为组成型启动子和诱导型启动子。组成型启动子是指能够使基因在所有组织中都能启动表达的启动子，又称为非特异型启动子。其调控不受外界条件的影响，所启动的基因表达大体恒定在一定水平上，具有持续性，但不表现时空特异性。诱导型启动子在某些特定的物理或化学信号的诱导刺激下，可以大幅度地提高基因的转录水平，没有诱导物存在时基因表达水平很低甚至没有。曲霉中蛋白的表达调控主要发生在转录水平，因此，在构建表达载体时使用高活性的真菌转录区域是进行高效表达的关键，即开发出一些强的，组成型的或者可调节型的启动子来调控蛋白的表达。曲霉表达系统中常用的启动子有cbh1(外切葡聚糖纤维二糖水解酶I)，glaA(葡萄糖淀粉酶)，gpdA(3-磷酸甘油醛脱氢酶)，amy(淀粉酶)。adhA(乙醛脱氢酶)，tpiA(磷酸丙糖异构酶)，pkiA蛋白激酶启动子，ghdA(泡盛曲霉谷氨酸脱氧酶)，oliC(线粒体合成酶ATP合成酶)和转录延伸因子。棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)属曲霉属，在自然界中分布较为广泛，常见于高等植物和土壤中，具有良好的蛋白分泌能力，棘孢曲霉可产生糖苷酶、蛋白酶和氧化酶等多种酶类，已广泛应用于产品发酵和制备工业酶制剂等方面，是重要的工业微生物。已有研究将棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶基因克隆到大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体pMG36e中，通过电转化将载体转化至乳酸乳球菌进行表达，实现在L.lactisMG1363中食品级分泌表达，并利用该酶的高活性水解能力水解风味物质前体，实现其在食品领域的应用。另外，有学者构建了含棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶I基因的毕赤酵母分泌多拷贝表达载体，成功在毕赤酵母中高表达分泌棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶I，可降低纤维素酶的处理成本。另有一株产纤维素酶的棘孢曲霉L22，它所产生的纤维素酶系具有外切酶酶活很低而内切酶酶活较高的特点，学者将其中一个酶组份内切葡聚糖苷酶II(EGII)基因在酿酒酵母中表达，达到了较高的表达效率，实现其在酶法脱墨领域中的应用。虽然棘孢曲霉的基因已在多个表达系统中实现了高效表达，但其在棘孢曲霉中的产量一直比较低。本专利技术通过筛选棘孢曲霉内源的启动子，构建得到高效表达棘孢曲霉基因的自克隆菌株。由于棘孢曲霉自克隆菌株没有引入任何其他的外源DNA片段，所以更容易被企业接受和应用到生产实践中，因此更有研究和应用价值。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术问题，提供了一种来源于棘孢曲霉的启动子及其在棘孢曲霉基因自克隆表达中的应用。所述启动子可显著提高棘孢曲霉内源基因的自克隆表达效率，从而降低棘孢曲霉产酶的生产成本，应用前景广阔。本专利技术一方面提供了一种启动子，其编码核苷酸序列如SEQIDNO：1或SEQIDNO：2或SEQIDNO：3或SEQIDNO：4所示。所述启动子在棘孢曲霉内源基因自克隆表达中的应用。本专利技术一方面提供了一种自克隆表达盒，包含上述启动子和棘孢曲霉的内源基因。所述内源基因包括鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶、内切-1，5-阿拉伯糖苷酶、果胶甲酯酶、果胶裂解酶、鼠李糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、酸性蛋白酶中的任意一种。所述内源基因优选鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶基因。所述鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO：12。所述内源基因优选内切-1，5-阿拉伯糖苷酶基因。所述内切-1，5-阿拉伯糖苷酶基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO：14。本专利技术还提供了一种棘孢曲霉自克隆菌株，包含上述自克隆表达盒。本专利技术进一步提供了一种突变菌株棘孢曲霉7177-2(Aspergillusaculeatus7177-2)，已于2019年11月4日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2019891。所述棘孢曲霉突变菌株在生产鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶中的应用。本专利技术进一步提供了一种突变菌株棘孢曲霉ALA-2(AspergillusaculeatusALA-2)，已于2019年11月25日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2019969。所述棘孢曲霉突变菌株在生产内切-1，5-阿拉伯糖苷酶中的应用。本专利技术提供的P422、P7177、P8175、P8515四个启动子可广泛应用于棘孢曲霉内源基因的自克隆表达，能显著提高基因的表达效率，尤其是P7177启动子的表达效率最高。其中，转入P7177启动子表达盒的自克隆菌株棘孢曲霉7177发酵上清液中鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶的酶活为53u/ml，比棘孢曲霉DSM2344提高了169倍；转入P7177启动子表达盒的自克隆菌株棘孢曲霉ALA-1发酵上清液中内切-1，5-阿拉伯糖苷酶的酶活最高，为7.40u/ml，比棘孢曲霉DSM2344提高了121倍。为了进一步提高鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶和内切-1，5-阿拉伯糖苷酶的产量，申请人分别以棘孢曲霉7177和棘孢曲霉ALA-1为出发菌株，通过紫外诱变筛选获得突变菌棘孢曲霉7177-2和棘孢曲霉ALA-2。其中，棘孢曲霉7177-2液体摇瓶发酵5d后，发酵上清液中鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶酶活达到79u/ml，比出发菌提高了49.1％；30L罐发酵160h后，发酵上清液中鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶酶活达到212u/ml，比出发菌提高了35.9％；棘孢曲霉ALA-2摇瓶发酵上清液中内切-1，5-阿拉伯糖苷酶的酶活达到10.77u/ml，比出发菌提高了45.5％，30L罐发酵160h后，棘孢曲霉ALA-2发酵上清液中的酶活力达到34.53u/ml，较出发菌提高了68.9％，取得了意料不到的技术效果。具体实施方式本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种启动子，其特征在于，所述启动子的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种启动子，其特征在于，所述启动子的编码核苷酸序列如SEQIDNO：1或SEQIDNO：2或SEQIDNO：3或SEQIDNO：4所示。


2.权利要求1所述的启动子在棘孢曲霉内源基因自克隆表达中的应用。


3.一种自克隆表达盒，其特征在于，所述自克隆表达盒包含权利要求1所述的启动子和棘孢曲霉的内源基因。


4.如权利要求3所述的自克隆表达盒，其特征在于，所述的内源基因包括鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶、内切-1，5-阿拉伯糖苷酶、果胶甲酯酶、果胶裂解酶、鼠李糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、酸性蛋白酶中的任意一种。


5.如权利要求4所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐晓东，陆娜，李连伟，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37