一种由双荧光素酶报告基因检测鸡RIPK2启动子活性的方法技术

本发明专利技术提供一种由双荧光素酶报告基因检测鸡RIPK2启动子活性的方法，包括以下步骤：步骤1）、鸡RIPK2基因启动子全长的克隆；步骤2）、鸡RIPK2启动子区系列缺失片段报告质粒的构建和鉴定；步骤3）、鸡RIPK2启动子活性定性分析；步骤4）、双荧光素酶报告基因检测鸡质粒RIPK2启动子的活性；步骤5）、鸡RIPK2核心启动子区的确定；步骤6）、鸡RIPK2核心启动子区转录因子的筛选；利用软件TRANSFAC和AliBaba 2.1对鸡RIPK2启动子区转录因子结合位点进行预测分析。通过本发明专利技术，便于对鸡RIPK2基因启动子的调控方式及调控元件进行研究。具有灵敏度高、准确性强、检测迅速、费用较低等特点，避免了转染效率对结果的影响。

【技术实现步骤摘要】
一种由双荧光素酶报告基因检测鸡RIPK2启动子活性的方法
本专利技术涉及一种由双荧光素酶报告基因检测鸡RIPK2启动子活性的方法，属于基因工程领域。
技术介绍
RIPK2是RIPK激酶家族的一个成员，主要通过NOD/RIPK2通路进行免疫炎症调节。抑制RIPK2基因可减少各种炎症因子的释放和缓解炎症反应综合征。而高表达RIPK2时可激活p38MAPK通路，能更有效的清除大肠杆菌。这表明RIPK2对胞内菌的识别、炎症反应的缓解以及其NOD/RIPK2通路对宿主免疫的调节都发挥着关键作用。因此，调控基因RIPK2的表达对机体免疫炎症的调节具有重要实践意义。基因表达是一个受时间和空间等多因素调控的复杂过程。基因是否表达通常由特定启动子是否启动来决定的。转录因子可以特异性结合启动子区的DNA序列，并协助RNA聚合酶在启动子区启动基因转录。启动子本身并不控制基因活动，而是通过转录因子结合位点与转录因子结合来控制基因活动。转录因子结合位点的改变可直接影响转录因子的结合，继而改变基因的转录效率并引起基因表达的差异。因此，筛选启动子核心区域即验证启动子最大活性区域对进一步探究基因的表达调控具有非常重要的现实意义。双荧光素酶报告基因检测系统使实验报告基因测试的结果归一化，具有检测速度快、灵敏度高等特点，且在哺乳动物中已应用的十分纯熟。本方法将鸡RIPK2基因启动子区系列缺失片段连接到荧光素酶报告载体pGL3-basic上，转染免疫细胞，检测荧光素酶活性，以确定鸡RIPK2基因启动子核心区域，为筛选调控鸡RIPK2表达的因素提供了一种快速便捷的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述问题，提供一种由双荧光素酶报告基因检测鸡RIPK2启动子活性的方法，本专利技术利用双荧光素酶报告基因检测系统，将不同长度的鸡RIPK2启动子插入荧光素酶报告质粒，检测荧光素酶表达量来确定启动子活性，为筛选调控鸡RIPK2表达的因素提供了一种快速便捷的方法。本专利技术的目的是这样实现的，一种由双荧光素酶报告基因检测鸡RIPK2启动子活性的方法，灵敏度高、检测迅速且费用较低，包括以下步骤：步骤1)、鸡RIPK2基因启动子全长的克隆；利用软件TFSEARCH和PROSCAN分析鸡RIPK2基因启动子区域，利用Primer5.0设计启动子区引物，具体为固定3′端，从5′端开始设计，每次截短500bp设计启动子区系列缺失片段7对引物，由上海生物工程有限公司合成；提取鸡巨噬细胞系HD11基因组DNA；PCR扩增出鸡RIPK2启动子区系列缺失片段；琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；对产物进行纯化；送上海生物工程有限公司进行测序分析；步骤2)、鸡RIPK2启动子区系列缺失片段报告质粒的构建和鉴定；将提纯后的不同长度的启动子片段和pGL3-basic连接，进行单酶切和双酶切，构建含有RIPK2启动子不同长度的不同重组质粒，并对其进行筛选和鉴定。步骤3)、鸡RIPK2启动子活性定性分析；将鸡RIPK2启动子全长的重组质粒转染至鸡巨噬细胞系HD11，48h后在倒置荧光显微镜下观察荧光表达状态；步骤4)、双荧光素酶报告基因检测鸡质粒RIPK2启动子的活性；将鸡RIPK2启动子报告质粒和pRL-TK共转染至鸡巨噬细胞系HD11中，24h后裂解细胞，并收集裂解液进行双荧光素酶检测；步骤5)、鸡RIPK2核心启动子区的确定；(1)构建鸡RIPK25′端缺失片段载体；对鸡RIPK25′端每隔500bp进行截短并设计特异性引物，构建重组报告质粒，分别命名为pGL3-basic-RIPK2-WT、pGL3-basic-RIPK2-1、pGL3-basic-RIPK2-2、pGL3-basic-RIPK2-3、pGL3-basic-RIPK2-4、pGL3-basic-RIPK2-5、pGL3-basic-RIPK2-6并进行双荧光素酶活性检测；(2)用脂质体转染试剂盒将不同长度的启动子荧光素酶报告质粒和内参质粒pRL-TK共转染至细胞中，并检测荧光素酶报告基因的表达活性；(3)通过对鸡RIPK2缺失片段载体启动子活性统计分析，初步确定RIPK2核心启动子位置；步骤6)、鸡RIPK2核心启动子区转录因子的筛选；利用软件TRANSFAC和AliBaba2.1对鸡RIPK2启动子区转录因子结合位点进行预测分析。步骤4)中，所述的双荧光素酶报告基因为Renilla荧光素酶基因。步骤1)中，所述的7对引物，引物pGL3-basic-RIPK2-WT的上游引物序列为5′-CGTGCTAGCCCGGGCTCGAGTGATAAACCACTGAAACTAA-3′，引物pGL3-basic-RIPK2-WT的下游引物序列为5′-AACAGTACCGGAATGCCAAGCTTCCGGCAGCTTGCTAGAGGG-3′，引物pGL3-basic-RIPK2-1的上游引物序列为5′-CGTGCTAGCCCGGGCTCGAGGGTCTGGAGCCCCCAGTACAA-3′，引物pGL3-basic-RIPK2-1的下游引物序列为5′-AACAGTACCGGAATGCCAAGCTTCCGGCAGCTTGCTAGAGGG-3′，引物pGL3-basic-RIPK2-2的上游引物序列为5′-CGTGCTAGCCCGGGCTCGAGGGGGCACTGGAGATTCATGAT-3′，引物pGL3-basic-RIPK2-2的下游引物序列为5′-AACAGTACCGGAATGCCAAGCTTCCGGCAGCTTGCTAGAGGG-3′，引物pGL3-basic-RIPK2-3的上游引物序列为5′-CGTGCTAGCCCGGGCTCGAGACAGTGCTACTGTCAGGAGTC-3′，引物pGL3-basic-RIPK2-3的下游引物序列为5′-AACAGTACCGGAATGCCAAGCTTCCGGCAGCTTGCTAGAGGG-3′，引物pGL3-basic-RIPK2-4的上游引物序列为5′-CGTGCTAGCCCGGGCTCGAGGAACAGGCTGCCCAGAGAAGC-3′，引物pGL3-basic-RIPK2-4的下游引物序列为5′-AACAGTACCGGAATGCCAAGCTTCCGGCAGCTTGCTAGAGGG-3′，引物pGL3-basic-RIPK2-5的上游引物序列为5′-CGTGCTAGCCCGGGCTCGAGTTGTGCCTTCAGTCGCATGCC-3′，引物pGL3-basic-RIPK2-5的下游引物序列为5′-AACAGTACCGGAATGCCAAGCTTCCGGCAGCTTGCTAGAGGG-3′，引物pGL3-basic-RIPK2-6的上游引物序列为5′本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种由双荧光素酶报告基因检测鸡RIPK2启动子活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1）、鸡RIPK2基因启动子全长的克隆；/n利用软件TFSEARCH和PROSCAN分析鸡RIPK2基因启动子区域，利用Primer 5.0设计启动子区引物，具体为固定3′ 端，从5′ 端开始设计，每次截短500bp设计启动子区系列缺失片段7对引物；提取鸡巨噬细胞系HD11基因组DNA；PCR扩增出鸡RIPK2启动子区系列缺失片段；琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；对产物进行纯化；/n步骤2）、鸡RIPK2启动子区系列缺失片段报告质粒的构建和鉴定；/n将提纯后的不同长度的启动子片段和pGL3-basic连接，进行单酶切和双酶切，构建含有RIPK2启动子不同长度的不同重组质粒，并对其进行筛选和鉴定；/n步骤3）、鸡RIPK2启动子活性定性分析；/n将鸡RIPK2启动子全长的重组质粒转染至鸡巨噬细胞系HD11，48h后在倒置荧光显微镜下观察荧光表达状态；/n步骤4）、双荧光素酶报告基因检测鸡质粒RIPK2启动子的活性；/n将鸡RIPK2启动子报告质粒和pRL-TK共转染至鸡巨噬细胞系HD11中，24h后裂解细胞，并收集裂解液进行双荧光素酶检测；/n步骤5）、鸡RIPK2核心启动子区的确定；/n（1）构建鸡RIPK2 5′ 端缺失片段载体；/n对鸡RIPK2 5′ 端每隔500bp进行截短并设计特异性引物，构建重组报告质粒，分别命名为pGL3-basic-RIPK2-WT、pGL3-basic-RIPK2-1、pGL3-basic-RIPK2-2、pGL3-basic-RIPK2-3、pGL3-basic-RIPK2-4、pGL3-basic-RIPK2-5、pGL3-basic-RIPK2-6并进行双荧光素酶活性检测；/n用脂质体转染试剂盒将不同长度的启动子荧光素酶报告质粒和内参质粒pRL-TK共转染至细胞中，并检测荧光素酶报告基因的表达活性；/n通过对鸡RIPK2缺失片段载体启动子活性统计分析，初步确定RIPK2核心启动子位置；/n步骤6）、鸡RIPK2核心启动子区转录因子的筛选；/n利用软件TRANSFAC和AliBaba 2.1对鸡RIPK2启动子区转录因子结合位点进行预测分析。/n...

【技术特征摘要】
1.一种由双荧光素酶报告基因检测鸡RIPK2启动子活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1）、鸡RIPK2基因启动子全长的克隆；
利用软件TFSEARCH和PROSCAN分析鸡RIPK2基因启动子区域，利用Primer5.0设计启动子区引物，具体为固定3′端，从5′端开始设计，每次截短500bp设计启动子区系列缺失片段7对引物；提取鸡巨噬细胞系HD11基因组DNA；PCR扩增出鸡RIPK2启动子区系列缺失片段；琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；对产物进行纯化；
步骤2）、鸡RIPK2启动子区系列缺失片段报告质粒的构建和鉴定；
将提纯后的不同长度的启动子片段和pGL3-basic连接，进行单酶切和双酶切，构建含有RIPK2启动子不同长度的不同重组质粒，并对其进行筛选和鉴定；
步骤3）、鸡RIPK2启动子活性定性分析；
将鸡RIPK2启动子全长的重组质粒转染至鸡巨噬细胞系HD11，48h后在倒置荧光显微镜下观察荧光表达状态；
步骤4）、双荧光素酶报告基因检测鸡质粒RIPK2启动子的活性；
将鸡RIPK2启动子报告质粒和pRL-TK共转染至鸡巨噬细胞系HD11中，24h后裂解细胞，并收集裂解液进行双荧光素酶检测；
步骤5）、鸡RIPK2核心启动子区的确定；
（1）构建鸡RIPK25′端缺失片段载体；
对鸡RIPK25′端每隔500bp进行截短并设计特异性引物，构建重组报告质粒，分别命名为pGL3-basic-RIPK2-WT、pGL3-basic-RIPK2-1、pGL3-basic-RIPK2-2、pGL3-basic-RIPK2-3、pGL3-basic-RIPK2-4、pGL3-basic-RIPK2-5、pGL3-basic-RIPK2-6并进行双荧光素酶活性检测；
用脂质体转染试剂盒将不同长度的启动子荧光素酶报告质粒和内参质粒pRL-TK共转染至细胞中，并检测荧光素酶报告基因的表达活性；
通过对鸡RIPK2缺失片段载体启动子活性统计分析，初步确定RIPK2核心启动子位置；
步骤6）、鸡RIPK2核心启动子区转录因子的筛选；
利用软件TRANSFAC和AliBaba2.1对鸡RIPK2启动子区转录因子结合位点进行预测分析。


2.根据权利要求1所述的一种由双荧光素酶报告基因检测鸡RIPK2启动子活性的方法，其特征在于，步骤4）中，所述的双荧光素酶报告基因为Renilla荧光素酶基因。


3.根据权利要求1所述的一种由双荧光素酶报告基因检测鸡RIPK2启动子活性的方法，其特征在于，步骤1）中，所述的7对引物，引物pGL3-basic-RIPK2-WT的上游引物序列为
5′-CGTGCTAGCCCGGGCTCGAGTGATAAACCACTGAAACTAA-3′，
引物pGL3-basic-RIPK2-WT的下游引物序列为
5′-AACAGTACCGGAATGCCAAGCTTCCGGCAGCTTGCTAGAGGG-3′，
引物pGL3-basic-RIPK2-1的上游引物序列为
5′-CGTGCTAGCCCGGGCTCGAGGGTCTGGAGCCCCCAGTACAA-3′，
引物pGL3-basic-RIPK2-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙红艳，李欢，牛英杰，左其生，张亚妮，李碧春，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32