一种岷江百合诱导型启动子PD1及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种岷江百合诱导型启动子PD1及其应用，其中诱导型启动子PD1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，本发明专利技术通过分子生物学和基因工程相关技术研究证实岷江百合启动子PD1响应几种植物激素、生物和非生物胁迫；将本发明专利技术岷江百合启动子PD1与β‑葡萄糖苷酸酶基因构建的融合基因表达框转入烟草中表达，通过荧光法定量检测转基因烟草的葡萄糖苷酸酶活性，结果表明转基因烟草在脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯、赤霉素、乙烯利、茄腐镰刀菌、伤胁迫和氯化钠处理后葡萄糖苷酸酶活性明显增强；本发明专利技术诱导型启动子PD1在抗生物或非生物胁迫的基因工程中具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种岷江百合诱导型启动子PD1及其应用
本专利技术涉及分子生物学以及基因工程相关研究领域，具体涉及一种诱导型启动子PD1及其应用。
技术介绍
启动子是提供RNA聚合酶识别和结合的一段DNA序列和相关的调控元件，通常位于基因的上游，激发或抑制基因的转录。启动子组成包括核心启动子与上游启动子元件。核心启动子由转录起始位点、TATA框和5'非翻译区序列组成。上游启动子元件包括CAAT框、GC框和一些组成型及特异型元件，这些元件结合相应的蛋白因子能够提高转录效率。启动子按功能及作用方式可分为三类：组成型启动子(基因的表达不受时空限制和外源因素的控制)、诱导型启动子(基因的表达受外源物理、化学因素的诱导，没有诱导物存在，基因表达水平很低甚至没有)和组织特异性启动子(基因的表达分布在植物的某个组织或器官中)。其中诱导型启动子能够在特定的环境条件诱导下激活下游基因的转录，从而影响植株的一些生理功能，以应对恶劣环境带来的伤害。植物基因工程是将外源基因导入受体细胞，使其与受体染色体整合，改变受体植物遗传特性的一种方法。它不但可以克服物种间的生殖隔离，还可以大大加快植物育种进程。基因工程中，外源基因的表达必须有启动子的驱动。在转基因植物中，组成型启动子持续过量表达外源基因会阻碍植物的生长并且降低其产量。而诱导型启动子，可使外源基因只在特殊的组织部位或诱导的情况下表达，因而不会因外源蛋白的持续表达影响植物正常生长，有很好的应用价值。诱导型启动子是在植物适应环境和长期进化过程中形成的，能够响应特殊的生物、物理、化学信号，进而提高特定基因转录水平，来适应一定范围内环境变化的一类启动子。在没有诱导因子存在的条件下，它控制的编码基因不表达或本底表达。一旦环境中出现诱导因子，编码基因表达迅速增加，在去除诱导因子后又会停止对基因的调控。在基因工程中，转入植物的外源基因如不加以控制，会在植物体内大量表达，导致蛋白大量积累且浪费能量。在载体上加入诱导型启动子可以在外界刺激时调控目的基因的表达，很好地解决了外源基因无限制表达的问题。并且诱导型启动子驱动外源基因的表达受特定的物理或化学信号控制，该特点使外源基因的表达可以得到更为精细的控制。因此针对诱导型启动子的研究一直是植物分子生物学和基因工程研究的热点之一（文添龙，刘雪梅,冀亚萍,俞嘉宁.高等植物胁迫诱导型启动子的研究进展.西北植物学报,2014,34(01):206-214）。诱导型启动子包括非生物诱导型启动子和生物因素诱导型启动子。非生物因素诱导型启动子包括干旱、盐刺激、温度等诱导型启动子，生物因素诱导型启动子即指病虫害诱导的启动子。从白粉病病菌（Oidiumheveae）基因组中分离得到一个WY195启动子，将WY195启动子连接报告基因GUS转入烟草中瞬时表达并给与适当的逆境处理，高温和干旱条件下诱导了WY195调控的GUS基因表达，表明WY195启动子受高温和干旱胁迫因子的诱导（WangY,RajaoferaM,ZhuL,etal.WY195,anewinduciblepromoterfromtherubberpowderymildewpathogen,canbeusedasanexcellenttoolforgeneticengineering.FrontiersinMicrobiology,2020,11:610252）。利用染色体步移技术，从岷江百合(Liliumregale)的PR10-5基因末端扩增出1489bp的启动子，并与GUS报告基因连接转入烟草(Nicotianatabacum)中，结果表明百合PR10-5启动子是一个多重应激诱导型启动子。赤霉素、脱落酸和乙烯对PR10-5启动子均有正调控的功能，其中赤霉素对启动子的诱导作用最强；盐胁迫和伤胁迫等非生物胁迫处理后，转基因烟草的GUS活性明显增强，表明盐胁迫和伤胁迫也正调控PR10-5启动子；尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum）和灰葡萄孢（Botrytiscinerea）处理对PR10-5启动子GUS活性的诱导也十分显著（ChenR,HeH,YangY,etal.Functionalcharacterizationofapathogenesis-relatedproteinfamily10gene,LrPR10-5,fromLiliumregaleWilson.AustralasPlantPath,2017,46(3):1-9）。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种诱导型启动子PD1，来源于岷江百合，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术另一目的是将该启动子应用在基因工程中，即在生物和非生物胁迫下作为诱导表达启动子调控外源基因在转基因受体植物中的特异高效表达。本专利技术涉及分离诱导型启动子片段并鉴定其表达活性，本专利技术从岷江百合中克隆获得诱导型启动子，该启动子长850bp；生物信息学分析表明该诱导型启动子中包含一系列不同的顺式作用元件。将本专利技术分离克隆的诱导型启动子片段置换pBI121载体上的CaMV35s启动子，由PD1驱动报告基因GUS的表达框，通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导将其转入模式植物烟草(Nicotianatabacum)中表达，并通过进一步实验揭示诱导型启动子PD1的表达特性，为后期利用该启动子调控外源基因在转基因植株中的高效特异表达奠定基础。专利技术人将这个启动子命名为PD1。将本专利技术中PD1启动子驱动GUS的表达框转入烟草中，采用几种植物激素、生物和非生物胁迫处理转基因烟草植株，并进行GUS活性的荧光定量分析，检测结果表明，PD1启动子响应采用几种植物激素、生物和非生物胁迫处理，脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯、赤霉素、乙烯利、茄腐镰刀菌、伤胁迫和氯化钠能明显诱导启动子PD1的活性。上述启动子PD1可以在基因工程中应用于外源基因的诱导表达，具体操作如下：(1)从岷江百合幼嫩组织中提取基因组DNA，采用扩增PD1的特异引物，通过聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)扩增出PD1，然后将其连接到pGEM-T载体上，经测序获得具有序列正确的克隆；(2)用限制性内切酶酶切pGEM-T-PD1载体，回收启动子片段；同时采用合适的限制性内切酶酶切去除植物表达载体上的组成型表达启动子，通过胶回收得到载体大片段；再将所获得PD1片段与pBI121-GUS载体片段连接，构建植物诱导表达载体；之后将所构建的植物诱导表达载体通过根癌农杆菌介导转入受体植物中。转基因植株在遭受茄腐镰刀菌侵染、伤胁迫、氯化钠胁迫时，启动子PD1驱动的目的基因会诱导并上调表达水平，此外，体内体外的脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯、赤霉素、乙烯利也会诱导目的基因高水平表达。本专利技术为植物基因工程应用中提供了一个新的诱导表达的启动子。基因工程中植物超表达载体常用来自花椰菜花叶病毒的35S启动子，该启动子为组成型表达启动子，目的基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织、部位表达水平没本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导型启动子PD1，来源于岷江百合，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种诱导型启动子PD1，来源于岷江百合，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

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【专利技术属性】
技术研发人员：刘迪秋，王自娥，邓婕，苏琳琳，梁婷婷，曲媛，葛锋，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53