Pcolce2调控内耳干细胞增殖分化方法及在毛细胞再生中的应用技术

本发明专利技术涉及内耳干细胞领域，具体的是Pcolce2调控内耳干细胞增殖分化方法及在毛细胞再生中的应用。Pcolce2调控内耳干细胞增殖分化方法，包括以下步骤：一、siRNA的选择；二、Lgr5+祖细胞的分离培养及Pcolce2基因敲除；三、Pcolce2基因敲除对Lgr5+祖细胞增殖/分化的影响；四、数据分析。本发明专利技术将从Pcolce2这个基因调控方面着手研究其对内耳毛细胞再生的作用。通过OC‑1细胞利用不同siRNA敲除Pcolce2基因，RT‑qPCR检测转染效果；分离培养Lgr5+内耳干细胞转染后检测增殖及分化，通过Lgr5+干细胞上进行成球分化实验表明Pcolce2基因敲低后，Lgr5+内耳干细胞的增殖显著降低，说明Pcolce2基因有促进内耳干细胞增殖的作用。

【技术实现步骤摘要】
Pcolce2调控内耳干细胞增殖分化方法及在毛细胞再生中的应用
本专利技术涉及内耳干细胞领域，具体的是Pcolce2调控内耳干细胞增殖分化方法及在毛细胞再生中的应用。
技术介绍
听力障碍是人类最常见的致残性感觉缺陷之一，其发病年龄和严重程度不同。大约每500名新生儿中就有1名患有先天性听力丧失。这些患儿的言语，认知和学习能力因听觉障碍受到很大的影响。不仅如此，随着人口老龄化的发展，越来越多的人随着年纪增大而伴随着听力减退的状况。在65-75岁的老年人中，患有耳聋疾病的人据统计高达60％。虽然耳聋并不致死，但其严重影响人们的工作能力和生活质量。因此，耳聋已经成为我国越来越亟需解决的社会问题。目前研究认为在哺乳动物耳蜗中当毛细胞由于噪音或药物而损伤后，不会自发的再生新的毛细胞，然而在非哺乳类脊椎动物的耳蜗中，却可以从支持细胞再生出新的毛细胞来替代已损失的毛细胞并恢复听觉功能。研究表明在离体培养中受损伤的新生耳蜗可以再生新的毛细胞；而Li首次发现成年小鼠椭圆囊感觉上皮中含有干细胞，这些干细胞可以分化成毛细胞，也能自我更新形成细胞球并传本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.Pcolce2调控内耳干细胞增殖分化方法，其特征在于，包括以下步骤：/n一、siRNA的选择/n采用N1603、N1130、N622三种不同的siRNA敲减OC-1细胞中的Pcolce2基因，细胞经三次传代后提取RNA，采用RT-qPCR技术检测OC-1细胞中Pcolce2基因的敲减效率，并与未敲减的对照组作比较；/n二、Lgr5+祖细胞的分离培养及Pcolce2基因敲除/n消化成单细胞后，采用流式细胞分选技术进行分选，经培养后再Pcolce2基因敲除；/n三、Pcolce2基因敲除对Lgr5+祖细胞增殖/分化的影响/n通过扫描电子显微镜、细胞免疫荧光的方法评估增殖情况和分化情况；/n四、...

【技术特征摘要】
1.Pcolce2调控内耳干细胞增殖分化方法，其特征在于，包括以下步骤：
一、siRNA的选择
采用N1603、N1130、N622三种不同的siRNA敲减OC-1细胞中的Pcolce2基因，细胞经三次传代后提取RNA，采用RT-qPCR技术检测OC-1细胞中Pcolce2基因的敲减效率，并与未敲减的对照组作比较；
二、Lgr5+祖细胞的分离培养及Pcolce2基因敲除
消化成单细胞后，采用流式细胞分选技术进行分选，经培养后再Pcolce2基因敲除；
三、Pcolce2基因敲除对Lgr5+祖细胞增殖/分化的影响
通过扫描电子显微镜、细胞免疫荧光的方法评估增殖情况和分化情况；
四、数据分析
采用GraphPadPrism6进行数据统计分析。


2.根据权利要求1所述的Pcolce2调控内耳干细胞增殖分化方法，其特征在于，所述步骤二中消化成单细胞的方法为：将新生Lgr5-EGFP小鼠耳蜗放入装有50ul1×PBS的1.5mlEP管中，用50ul0.25％胰酶-EDTA在37℃下培养8-12min后消化成单细胞。


3.根据权利要求1所述的Pcolce2调...

【专利技术属性】
技术研发人员：柴人杰，袁佳，张莎莎，程诚，高下，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32