一种在原生质体细胞中高效表达目标基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种在原生质体细胞中高效表达目标基因的方法。所述方法包括如下步骤：以DNA分子作为启动子来启动目标基因的表达，所述DNA分子为如下1)或2)或3)：1)SEQ ID No.3所示的DNA分子；2)与1)限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。通过实验证明：该DNA分子可高效与稳定的驱动目标基因在苹果原生质体细胞中进行表达，突破了在苹果原生质体细胞中应用CaMV 35S启动子部分基因不表达，部分基因表达较弱的技术局限。

【技术实现步骤摘要】
一种在原生质体细胞中高效表达目标基因的方法
本专利技术涉及植物生物技术与生物化学领域，尤其涉及一种在原生质体细胞中高效表达目标基因的方法。
技术介绍
苹果是蔷薇科苹果亚科苹果属植物，营养价值很高，富含矿物质和维生素，含钙量丰富，有助于代谢掉体内多余盐分，苹果酸可代谢热量，防止下半身肥胖。苹果中营养成分可溶性大，容易被人体吸收，故有“活水”之称。它有利于溶解硫元素，使皮肤润滑柔嫩。我国是世界上最大的苹果生产和消费国，面积和产量均居世界首位。对苹果中重要功能基因的研究，有助于揭示其细胞信号转导的分子机理及对逆境的响应机制。胚性愈伤组织作为一种良好的试验试材，广泛应用于植物的遗传转化、再生植株等研究，是游离原生质体的良好试材；无细胞壁的原生质体的代谢过程、信号转导途径、对环境因素和外来刺激的反应等，都与完整的植物细胞或组织基本相同，通过向原生质体细胞中导入目标基因或目标基因与报告基因融合的DNA，利用报告基因在植物原生质体中的瞬时表达可以快速准确地进行相关基因功能、蛋白质互作及细胞代谢过程等研究，为在细胞水平上研究植物的生理变化、基因表达、信号传递等提供了简便有效的实验体系。
技术实现思路
本专利技术首先提供了一种DNA分子。所述提供的DNA分子为如下1)或2)或3)：1)SEQIDNo.3所示的DNA分子；2)与1)限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。本专利技术又提供了含有上述DNA分子的生物材料。本专利技术提供的含有上述DNA分子的生物材料为下述B1)至B11)中的任一种：B1)含有权利要求1所述DNA分子的表达盒；B2)含有权利要求1所述DNA分子的重组载体；B3)含有B1)所述表达盒的重组载体；B4)含有权利要求1所述DNA分子的重组微生物；B5)含有B1)所述表达盒的重组微生物；B6)含有B2)所述重组载体的重组微生物；B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；B8)含有权利要求1所述DNA分子的转基因细胞系；B9)含有B1)所述表达盒的转基因细胞系；B10)含有B2)所述重组载体的转基因细胞系；B11)含有B3)所述重组载体的转基因细胞系。上述生物材料中，所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子、由所述DNA分子启动表达的目标基因，以及转录终止序列组成。所述重组载体可为重组表达载体或重组克隆载体。扩增上述DNA分子或其任一片段的引物对也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供了上述DNA分子或生物材料的新用途。本专利技术提供了上述DNA分子在作为启动子中的应用。本专利技术还提供了上述DNA分子或含有上述DNA分子的生物材料在启动目标基因表达中的应用。上述应用中，所述启动目标基因表达为在植物细胞中启动目标基因表达。所述植物可为双子叶植物或单子叶植物；具体的，所述双子叶植物可为苹果属植物；更具体的，所述苹果属植物为苹果。所述植物细胞可为原生质体细胞；具体的，所述原生质体细胞为苹果原生质体细胞。本专利技术最后提供了一种表达目标基因的方法。本专利技术提供的表达目标基因的方法包括如下步骤：以上述DNA分子作为启动子来启动目标基因的表达。上述方法中，所述表达目标基因为在苹果原生质体细胞中表达目标基因；所述苹果原生质体细胞是以在添加植物激素的MS培养基上生长10天的苹果愈伤组织细胞为试材分离制备得到的苹果原生质体细胞。所述苹果原生质体细胞可为Orin苹果愈伤组织细胞或紫红2-4苹果愈伤组织细胞。当所述苹果原生质体细胞为Orin苹果愈伤组织细胞时，所述植物激素为2,4-D(1.5mg/L)和6-BA(0.4mg/L)；当所述苹果原生质体细胞为紫红2-4苹果愈伤组织细胞时，所述植物激素为NAA(0.6mg/L)和6-BA(0.5mg/L)。并以第10天的愈伤组织细胞制备苹果原生质体细胞最佳。以上任一所述应用或方法中，所述目标基因可为如下基因中的任一种或几种或全部：MdERF98、MdERF1、MdERF2、MdERF3和MdERF6。本专利技术从苹果中克隆得到一种具有启动子功能的核苷酸片段。通过实验证明：该核苷酸片段可高效与稳定的驱动调控苹果果实成熟与免疫反应中具有代表性的目标基因在苹果原生质体细胞中进行表达，突破了在苹果原生质体细胞中应用CaMV35S启动子部分基因不表达，部分基因表达较弱的技术局限，为将苹果原生质体细胞蛋白表达技术应用于苹果信号转导研究奠定了基础。附图说明图1为用于分离制备苹果原生质体细胞的苹果愈伤组织细胞。a：在MS培养基上生长的Orin苹果愈伤组织细胞；b：在MS培养基上生长的紫红2-4苹果愈伤组织细胞；c：富士与新疆野苹果杂交后代叶片诱导出的4个初始细胞系。a、b所示苹果愈伤组织细胞用于苹果原生质体细胞分离。图2为苹果愈伤组织细胞中分离出的苹果原生质体细胞。a：从MS培养基上生长不同天数的Orin苹果愈伤组织细胞中分离的苹果原生质体细胞；b：从MS培养基上生长不同天数的紫红2-4苹果愈伤组织细胞中分离的苹果原生质体细胞。图中天数为用于分离苹果原生质体细胞的苹果愈伤组织细胞在MS培养基上生长的天数。比例尺示50μm。图3为应用Pro-BIUTNT启动子的母本表达载体构建。a：表达载体构建方案；b：Pro-BIUTNT克隆进表达载体的图例展示。图4为应用CaMV35S、Pro-BIUTNT两种类型启动子的参试目标基因的表达载体构建。a：表达载体构建过程；b：参试目标基因开放阅读框全长扩增结果；c：参试目标基因的表达载体酶切鉴定；d：虚线以上为分别应用CaMV35S、Pro-BIUTNT两种启动子的目标基因的表达载体结构图，虚线以下为应用Pro-BIUTNT启动子的目标基因的表达载体结构图，(左)为载体构建中使用的母本载体(“质粒1”、“质粒3”、“质粒4”、“质粒5”)，(中)为参试目标基因表达载体结构图，(右)为表达载体中的参试目标基因集合，CCCCCT(*所示)为表达载体构建中SmaI、StuI酶切末端连接形成的序列，该序列存在于应用SmaI酶切克隆的MdBAK1、MdFLS2、MdWRKY29、MdWRKY33-1、AtFLS2的表达载体中。图5为应用苹果中核苷酸序列为启动子驱动目标基因MdERF98的表达载体构建。a：表达载体构建方案；b：目标基因MdERF98克隆进母本载体“质粒3”图例展示；c：6个苹果中核苷酸序列作为启动子克隆进目标基因为MdERF98的表达载体图例展示；d：应用苹果中核苷酸序列为启动子的MdERF98表达载体(“质粒7”-“质粒12”)及载体构建中的中间载体的结构图。图6为Pro-BIUTNT与CaMV35S启动子驱动目标基因MdERF1、MdERF2、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.DNA分子，为如下1)或2)或3)：/n1)SEQ ID No.3所示的DNA分子；/n2)与1)限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子；/n3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。/n

【技术特征摘要】
20200302 CN 20201013512841.DNA分子，为如下1)或2)或3)：
1)SEQIDNo.3所示的DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。


2.含有权利要求1所述DNA分子的生物材料，为下述B1)至B11)中的任一种：
B1)含有权利要求1所述DNA分子的表达盒；
B2)含有权利要求1所述DNA分子的重组载体；
B3)含有B1)所述表达盒的重组载体；
B4)含有权利要求1所述DNA分子的重组微生物；
B5)含有B1)所述表达盒的重组微生物；
B6)含有B2)所述重组载体的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有权利要求1所述DNA分子的转基因细胞系；
B9)含有B1)所述表达盒的转基因细胞系；
B10)含有B2)所述重组载体的转基因细胞系；
B1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宪璞，张芮，刘秀霞，张彬彬，辛丽，王立双，陈学森，吴树敬，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37