一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法及应用试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法及应用试剂盒，属于分析检测领域。一种脱氧核酶，所述脱氧核酶包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链，在SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链的5'端连有羟基，3'端连有胆固醇分子。一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法的步骤简单、响应快速，可实现对细胞外分泌ATP分子的快速传感与测定，可有效区分其他细胞外核苷酸包括ADP、AMP和腺苷等物质，实现准确测定，可广泛应用于细胞生长、组织损伤、炎症和移植免疫等各种生理和病理研究过程中，可更好地理解ATP的信号机制以及其在基本病理、生理过程中的功能。

【技术实现步骤摘要】
一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法及应用试剂盒
本专利技术属于分析检测领域，具体涉及一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法及应用试剂盒。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。自1994年首次通过体外筛选技术获得具有催化活性的DNA(又称脱氧核酶或DNAzyme)以来，到目前为止，已经发现了许多可催化裂解RNA的DNAzymes(简称RCDz)。这些RCDz广泛应用于临床诊断、药物研发、环境监测和生物传感等领域。例如，RCDz可作为传感器和显像剂用于细胞内金属离子以及其他目标分子成像。但时间分辨率较低，这些RCDz传感器通常需要数分钟甚至数小时才能读出信号，这极大的限制了其传感性能。因此，亟需开发具有高时间分辨率或快速响应的DNAzyme传感器。三磷酸腺苷(ATP)是一种重要的细胞外信号指示剂，在细胞生长、组织损伤、炎症和移植免疫等各种生理和病理过程中，细胞都会向外释放ATP。因此，监控ATP的释放过程，可以更好地理解其信号机制以及研究相关的病理、生理过程。尽管已经研发出基于核酸适配体的传感器，用于分析细胞内ATP，但是针对细胞间复杂的信号传递的情况下，该方法无法保证对ATP的检测特异性，甚至无法区分细胞外的ADP和AMP，因此，对细胞外ATP的监测仍然是一个重大挑战和技术难点。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法。利用具有自磷酸化催化功能的特定结构的脱氧核苷酸链为传感分子(已修饰荧光基团，简称FDK1)，并将其固定至细胞膜表面，当细胞释放ATP分子时，FDK1可催化底物ATP分子的γ-磷酸基团移到其自身序列的5'-羟基端，实现磷酸化，再与具有荧光猝灭基团(QDO)的DNA链进行碱基互补配对，完成荧光猝灭，形成较低的荧光检测背景，利用λ噬菌体核酸外切酶(λ-exo)将5'-磷酸化的脱氧核苷酸链分子切割至短链，进而产生强烈的荧光信号，可在数秒内完成细胞外ATP分子的快速传感。本专利技术的技术方案为：一种脱氧核酶，所述脱氧核酶包括如SEQIDNO.2所示的脱氧核苷酸链，在SEQIDNO.2所示的脱氧核苷酸链的5'端连有羟基，3'端连有胆固醇分子。进一步地，上述技术方案中，所述脱氧核酶具有自磷酸化催化功能，可以固定在细胞膜表面。一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法，脱氧核酶催化底物ATP分子的γ-磷酸基团移到脱氧核酶自身序列的5'-羟基端，磷酸化的脱氧核酶再与SEQIDNO.3所示的具有荧光猝灭基团(QDO)的DNA链进行碱基互补配对，利用λ噬菌体核酸外切酶(λ-exo)将5'-磷酸化的脱氧核苷酸核酶切割至短链，产生荧光信号，完成细胞外ATP分子传感。进一步地，上述技术方案中，一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法，包括以下步骤：a)对SEQIDNO.1所示的ATP识别分子进行荧光标记，形成SEQIDNO.2所示的所示的脱氧核酶；b)在脱氧核酶的3'端修饰胆固醇分子，使脱氧核酶可与细胞膜反应，将脱氧核酶固定在细胞膜表面；c)将细胞在玻璃基培养皿中孵育；d)向细胞玻璃基培养皿中加入脱氧核酶，进行孵育，使脱氧核酶被固定在细胞膜表面，固定后采用洗涤液洗涤细胞；e)向步骤d)中的细胞加入带有金属离子辅助因子的缓冲溶液，用于辅助脱氧核酶自磷酸化催化过程；f)对步骤e)中的细胞进行刺激，使细胞释放出ATP分子；g)向步骤f)中的细胞中加入SEQIDNO.3所示的荧光猝灭试剂(QDO)和λ噬菌体核酸外切酶(λ-exo)，在37℃下孵育；h)采用激光扫描共焦显微镜对细胞进行成像，激发和发射波长与所用荧光标记的分子的激发和发射波长相匹配，使用ImageJ软件计算定量数据。进一步地，上述技术方案中，所述步骤a)中荧光标记的分子为FAM或者Cy5。进一步地，上述技术方案中，所述步骤d)中向细胞玻璃基培养皿中加入脱氧核酶的浓度为100～300nmol/L，洗涤液成分为20～30mmol/LHEPES，120～140mmol/LNaCl，5～10mmol/LKCl，1～3mmol/LCaCl2，2～4mmol/LMgCl2，3～6mmol/L葡萄糖。进一步地，上述技术方案中，所述步骤e)中带有金属离子辅助因子的缓冲溶液中的金属离子包括Mn2+、Cd2+或Zn2+，在Cd2+或Zn2+的作用下，脱氧核酶的活性略有降低，优化的Mn2+的最佳浓度为10mmol/L；所述带有金属离子辅助因子的缓冲溶液还包括100～120mmol/LHEPES，600～900mmol/LNaCl，100～300mmol/LKCl。进一步地，上述技术方案中，所述步骤f)中的刺激包括化学刺激或者物理刺激，所述化学刺激包括谷氨酸刺激、凝血酶刺激或钙离子刺激，所述物理刺激包括采用微电极进行电刺激、机械刺激或流体剪切应力刺激。进一步地，上述技术方案中，所述步骤g)中的λ噬菌体核酸外切酶(λ-exo)的最终浓度为20～30μmol/L，荧光猝灭试剂(QDO)的最终浓度为1～3μmol/L。一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速检测试剂盒，包括SEQIDNO.2所示的脱氧核酶、带有Mn2+、Cd2+或Zn2+辅助因子的缓冲溶液、SEQIDNO.3所示的荧光猝灭试剂和λ噬菌体核酸外切酶。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术方法具有快速响应的优势(反应时间在亚秒数量级)。2、本专利技术方法的特异性好，可在细胞外部环境中有效区分其他核苷酸(ADP、AMP、UTP、UDP和腺苷)，对ATP分子的传感结果更准确。3、本专利技术方法可实时监测ATP的释放过程，可广泛应用于细胞生长、组织损伤、炎症和免疫移植等各种生理和病理研究过程中，可更好地理解其信号机制以及研究相关的病理、生理过程。附图说明图1为本专利技术中涉及的FDK1分子的检测原理图(a)及检测流程示意图(b)。图2为本专利技术实施例1中利用FDK1分子对MCF-7细胞在添加ATP条件下的荧光传感照片。图3为本专利技术实施例2中利用FDK1分子对鼠脑星形胶质细胞在谷氨酸刺激条件下的荧光传感照片，其中形式如图3(a)、3(b)分别为在谷氨酸刺激下，细胞的荧光成像照片；图3(c)为以无自磷酸化催化功能的MFDK1分子标记细胞后，在谷氨酸的刺激下，细胞的荧光照片；图3(d)为图3(a)所示细胞在不同浓度的谷氨酸刺激下，细胞的荧光/背景信号比值。图4为本专利技术实施例3中对鼠脑星形胶质细胞进行机械刺激实物照片(a)及ATP分子成像荧光照片(b)。图5为本专利技术实施例3中对鼠脑星形胶质细胞进行电流刺激的实验原理图(a)和在不同电流强度刺激下，ATP分子的成像荧光照片：(b)为10pA电流强度，(c)为40pA电流强度，(d)为100pA电流强度。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脱氧核酶，其特征在于：所述脱氧核酶包括如SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链，在SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链的5'端连有羟基，3'端连有胆固醇分子。/n

【技术特征摘要】
1.一种脱氧核酶，其特征在于：所述脱氧核酶包括如SEQIDNO.2所示的脱氧核苷酸链，在SEQIDNO.2所示的脱氧核苷酸链的5'端连有羟基，3'端连有胆固醇分子。


2.根据权利要求1所述的一种脱氧核酶，其特征在于：所述脱氧核酶具有自磷酸化催化功能，可以固定在细胞膜表面。


3.一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法，其特征在于：权利要求1或2所述的脱氧核酶催化底物ATP分子的γ-磷酸基团移到脱氧核酶自身序列的5'-羟基端，磷酸化的脱氧核酶再与SEQIDNO.3所示的具有荧光猝灭基团的DNA链进行碱基互补配对，利用λ噬菌体核酸外切酶将5'-磷酸化的脱氧核酶切割至短链，产生荧光信号，完成细胞外ATP分子传感。


4.根据权利要求3所述的一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法，其特征在于：包括以下步骤：
a)对SEQIDNO.1所示的ATP识别分子进行荧光标记，形成SEQIDNO.2所示的所示的脱氧核酶；
b)在脱氧核酶的3'端修饰胆固醇分子，使脱氧核酶可与细胞膜反应，将脱氧核酶固定在细胞膜表面；
c)将细胞在玻璃基培养皿中孵育；
d)向细胞玻璃基培养皿中加入脱氧核酶，进行孵育，使脱氧核酶被固定在细胞膜表面，固定后采用洗涤液洗涤细胞；
e)向步骤d)中的细胞加入带有金属离子辅助因子的缓冲溶液，用于辅助脱氧核酶自磷酸化催化过程；
f)对步骤e)中的细胞进行刺激，使细胞释放出ATP分子；
g)向步骤f)中的细胞中加入SEQIDNO.3所示的荧光猝灭试剂和λ噬菌体核酸外切酶，孵育；
h)采用激光扫描共焦显微镜对细胞进行成像，激发和发射波长与所用荧光标记的分子的激发和发射波长相匹配，使用ImageJ软件计算荧光定量数据。

【专利技术属性】
技术研发人员：刘猛，石蒙，赵丹，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21