靶向敲除GLK基因的CRISPR/Cas9系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种靶向敲除GLK基因的CRISPR/Cas9系统及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术通过设计、构建、筛选，最终提供一些基于CRISPR/Cas9系统，同时能靶向白桦GLK基因的高效gRNA及靶位点序列，具体以白桦GLK基因为编辑靶基因，将体外纯化的Cas9蛋白与GLK‑gRNA混合后的核糖核蛋白复合体RNP，通过微粒轰击白桦愈伤组织，初步建立无T‑DNA插入基因编辑技术，利用该基因编辑技术获取了白桦黄叶植株，这为丰富白桦品种以及快速创制白桦植物突变体提供了崭新思路。

【技术实现步骤摘要】
靶向敲除GLK基因的CRISPR/Cas9系统及其应用
本专利技术涉及分子生物学
，涉及一种靶向敲除GLK基因的CRISPR/Cas9系统及其应用。
技术介绍
GLK转录因子促进许多核编码的光合作用基因的表达，这些基因与叶绿素的生物合成有关。GLK基因已经参与了拟南芥和苔藓小叶藓(Physcomitrellapatens)叶绿体发育的调控。此外，异位表达GLKs能够诱导拟南芥、水稻根和愈伤组织等非绿色组织中叶绿体的产量增加，提高番茄中细胞叶绿体数量，表明GLKs在质体发育中的重要作用。冮慧欣等在BpGLK基因功能的进行了更深入的研究，主要鉴定了T-DNA插入突变株的表型和突变基因，总结了T-DNA整合模式，研究了突变基因BpGLK的功能，叶片颜色形成的机制及其机理。研究结果可为GLK基因在木本植物中的应用提供基础，使人类能够利用分子工程技术创造出黄叶特色性状树，以满足园林绿化的需要。同时，白桦BpGLK抑制的表达谱系也可为提供黄色高大乔木资源用于美化环境。以往在开展植物CRISPR/Cas9定点编辑技术中，人们主要利用根癌农杆菌介导法在T-DNA的驱动下，将Cas9蛋白-gRNA核糖核蛋白复合物(RNP)导入受体细胞，结果在获得的基因组编辑植物宿主基因组中仍含有外源DNA序列(根癌农杆菌的DNA序列、抗性基因等)，尤其对于木本科植物白桦来说，个体发育的生命周期时间本身较长，虽然通过有性杂交技术可以去除这些外源基因，但所需周期会更长。目前，通过微粒轰击技术将Cas9蛋白-gRNA核糖核蛋白复合物(RNP)导入受体细胞，可获得无选择标记基因、无T-DNA插入的基因编辑植物，该技术的提出为快速创制白桦植物突变体提供了崭新思路。为了利用此技术进行白桦基因编辑研究，本专利技术以白桦GLK基因为编辑靶基因，将体外纯化的Cas9蛋白与GLK-gRNA混合后的核糖核蛋白复合体(RNP)，通过微粒轰击白桦愈伤组织，初步建立无T-DNA插入基因编辑技术，为今后创制白桦突变体提供参考。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种靶向敲除GLK基因的CRISPR/Cas9系统及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过设计、构建、筛选，最终提供一些基于CRISPR/Cas9系统，同时能靶向白桦GLK基因的高效gRNA及靶位点序列，并用其获得了无选择标记基因、无T-DNA插入的基因编辑的白桦黄叶植株，该技术的提出为快速创制白桦植物突变体提供了崭新思路。为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：本专利技术提供一种敲除GLK基因的gRNA，包括以下所述序列的任意一条：gRNA-1：5′-GTCAGCTTTGAGGAACACAAAGG-3′；gRNA-2：5′-ACTACCCAGACTTCTCCGATGGG-3′；gRNA-3：5′-GCCGACTTATCCGTTAGCGGCGG-3′；gRNA-4：5′-CCGACTTATCCGTTAGCGGCGGT-3′。本专利技术还提供一种gRNA位点靶向敲除GLK基因的CRISPR/Cas9系统，包括所述的gRNA-1、gRNA-2、gRNA-3以及gRNA-4中的任意一条DNA序列。本专利技术还提供根据所述的gRNA位点靶向敲除GLK基因的CRISPR/Cas9系统构建GLK基因敲除的植物突变体的方法，包括以下步骤：以GLK基因为编辑靶基因，将体外纯化的Cas9蛋白与GLK-gRNA混合后的核糖核蛋白复合体，通过微粒轰击植物体愈伤组织，转化后的愈伤组织经过继续培养和植株再生，获得无选择标记基因、无T-DNA插入的基因编辑的植物突变体。优选的是，所述植物愈伤组织来源于白桦。本专利技术还提供一种根据所述的敲除GLK基因的gRNA或所述的gRNA位点靶向敲除GLK基因的CRISPR/Cas9系统在构建GLK基因敲除的植物突变体中的应用。优选的是，所述植物突变体为白桦突变体。本专利技术公开了以下技术效果：本专利技术以白桦GLK基因为编辑靶基因，将体外纯化的Cas9蛋白与GLK-gRNA混合后的核糖核蛋白复合体(RNP)，通过微粒轰击白桦愈伤组织，初步建立无T-DNA插入基因编辑技术。该技术改变了现有技术中直接采用CRISPR/Cas9系统定点编辑时，宿主细胞仍然含有外源DNA序列，以及利用有性杂交去除这些外源基因增加生育周期的缺陷等，经过该技术创建的物T-DNA插入的编辑技术，获取了白桦黄叶植株并且能正常利用叶绿体生长，为丰富白桦品种以及快速创制白桦植物突变体提供了崭新思路。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为pAbAi-GLK-E1重组载体简图；图2为pAbAi-GLK-E1酶切电泳图谱；其中，M：DL15000；1-4pAbAi-GLK-E1质粒；图3为CRISPPR/Cas9酶切靶点序列效率图；其中，M：DL10000；1-4：依次为由gRNA1-4与Cas蛋白构建的gRNA-Cas9蛋白复合物；5：阳性对照；6：空载(阴性对照)；7：无Cas9蛋白对照；8：无gRNA对照；图4为愈伤组织不同培养阶段生长状态；其中，a为合子胚培养阶段；b和c为体式显微镜下的glkc愈伤组织；图5为glk基因编辑株系测序比对图；图6为体式显微镜下观察获得的白桦glk编辑植株；其中，a、b为glkc株系；c为对照白桦。具体实施方式现以实施例方式对本专利技术技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。以下实施例中无特殊说明所使用的试剂或其他材料均能通过商业渠道获取。以下实施例中所使用的白桦相关材料采集于东北林业大学白桦强化种子园。实施例1BpGLK基因靶位点的预测及gRNA活性检测1、BpGLK基因靶位点的预测以及gRNA序列设计根据白桦BpGLK(Bpev01.c0167.g0013.m0001)的基因序列和编码区序列，利用CRISPR-direct网页(http://crispr.dbcls.jp/)筛选具有特异性靶点。即找到该基因的CDS区序列中NGG(N为A，T，C或G)，最好是AGG，取NGG前面的20bp作为目标靶序列，以便提高基因敲除效率。根据靶点序列设计gRNA，具体见表1。表1gRNA序列2、gRNA的合成及活性检测在gRNA序列前端加上T7启动子序列：TAATACGACTCACTATAG；在gRNA序列后端加上向导序列GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGG(茎环结构)；利用表2gRNA合成用引物、表3gRNA的保守区段序列、以及表4PCR扩增体系、表5P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种敲除GLK基因的gRNA，其特征在于，包括以下所述序列的任意一条：/ngRNA-1：5′-GTCAGCTTTGAGGAACACAAAGG-3′；/ngRNA-2：5′-ACTACCCAGACTTCTCCGATGGG-3′；/ngRNA-3：5′-GCCGACTTATCCGTTAGCGGCGG-3′；/ngRNA-4：5′-CCGACTTATCCGTTAGCGGCGGT-3′。/n

【技术特征摘要】
1.一种敲除GLK基因的gRNA，其特征在于，包括以下所述序列的任意一条：
gRNA-1：5′-GTCAGCTTTGAGGAACACAAAGG-3′；
gRNA-2：5′-ACTACCCAGACTTCTCCGATGGG-3′；
gRNA-3：5′-GCCGACTTATCCGTTAGCGGCGG-3′；
gRNA-4：5′-CCGACTTATCCGTTAGCGGCGGT-3′。


2.一种gRNA位点靶向敲除GLK基因的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，包括权利要求1中所述的gRNA-1、gRNA-2、gRNA-3以及gRNA-4中的任意一条DNA序列。


3.根据权利要求1-2任一项所述的gRNA位点靶向敲除GLK基因的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘桂丰，王伟，邱志楠，李爽，姜静，陈肃，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23