一种构建甲状腺功能障碍及心脏长QT综合征双表型大鼠模型的方法技术

本发明专利技术涉及一种构建甲状腺功能障碍及心脏长QT综合征双表型大鼠模型的方法，主要基于KCNQ1基因修饰实现模型构建过程，本发明专利技术利用Crisper/Cas9技术全身敲除大鼠延迟整流钾离子通道KCNQ1基因，通过ELISA实验检测成年大鼠血清中甲状腺激素水平的变化，同时利用Powerlab数据分析系统检测大鼠心脏电活动的改变，成功获得了甲状腺功能障碍及心脏长QT综合征双表型大鼠模型。与现有技术相比，本发明专利技术通过大鼠体内KCNQ1基因的遗传操作，理解该基因对甲状腺功能和心脏功能的双重影响以及二者之间的关联，对全面解析KCNQ1基因突变影响心脏功能的复杂分子机制具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种构建甲状腺功能障碍及心脏长QT综合征双表型大鼠模型的方法
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种基于KCNQ1基因敲除构建甲状腺功能障碍和心脏长QT综合征大鼠模型的构建方法。
技术介绍
离子通道是细胞膜上的蛋白质孔道，离子的跨膜流动是细胞传递信息的基础。钾通道是一类普遍存在的膜蛋白，在细胞电生理过程中发挥着极为重要的作用。KCNQ1编码一种电压门控型钾通道，主要分布在心脏以及肾、胃、肠、内耳、上皮、甲状腺等组织中。当KCNQ1基因发生突变，可导致长QT综合征(longQTsyndrome，LQTS)。作为一种重要的钾离子通道，KCNQ1钾通道也在除心脏之外的其他组织发挥作用。在甲状腺组织中，KCNQ1编码的α亚基与KCNE2编码的β亚基共同组成复合体，锚定在甲状腺滤泡上皮细胞的基底膜，可以协助钠碘转运蛋白NIS进行I-的摄取，在甲状腺激素的合成过程中起到关键作用。目前尚无成熟的KCNQ1基因敲除大鼠模型构建案例，若能成功地建立该模型，可以方便在动物体内研究该基因，对于理解KCNQ1基因突变影响心脏功能的分子机制具有关键意义。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种基于Crisper/Cas9技术全身敲除大鼠KCNQ1基因，成功实现了甲状腺功能障碍及心脏长QT综合征双表型的大鼠模型方法。本技术方案的技术起点为：在大鼠中敲除KCNE2基因会造成其血清中甲状腺激素水平降低，并且哺乳期大鼠可出现心脏肥大、脱毛、发育减缓等症状，同时利用野生型母鼠在哺乳期对KCNE2基因敲除大鼠进行代养后，KCNE2敲除乳鼠心脏肥大，发育减缓的表型均可得到一定程度的缓解。由此可见同时分布于心脏组织和甲状腺组织的离子通道基因如果发生功能缺失型突变，可同时影响甲状腺功能和心脏功能。此外，离子通道基因突变引起的甲状腺功能改变可能与心脏功能的变化存在重要的联系。因此，研究KCNQ1基因突变对甲状腺功能、心脏功能以及二者之间的关联对于理解KCNQ1基因突变影响心脏功能的分子机制具有关键意义。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：本专利技术的第一个目的是保护一组靶向大鼠KCNQ1基因的sgRNA，所述sgRNA包括sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3，其中sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3的靶点特异性序列分别如：SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。本专利技术的第二个目的是保护一种KCNQ1基因敲除大鼠的模型构建方法，包括以下步骤：S1：构建针对大鼠KCNQ1基因的sgRNA，所述sgRNA包括sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3，sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3的靶点特异性序列分别如：SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示；S2：将S1中所述sgRNA与Cas9核酸酶体外转录成mRNA，之后将所述mRNA注射到大鼠受精卵中，再移植入代孕大鼠，获得F0代大鼠；S3：对获得的F0代大鼠中尾部基因进行鉴定，对F0代大鼠血清甲状腺激素指标的检测，对F0代大鼠心电图数据进行采集并与预设指标进行分析，获得KCNQ1基因敲除大鼠模型。进一步地，S1中所述sgRNA的构建方式为：利用pCR-BluntII-TOPO作为载体骨架，选择药物筛选抗性为Kanamycin，启动子为U6，构建三条KCNQ1基因的sgRNAs。进一步地，所述KCNQ1基因敲除位点位于第2号外显子上，通过Crisper/cas9技术插入胸腺嘧啶造成移码突变。进一步地，S3中所述尾部基因进行鉴定过程中，PCR鉴定引物序列如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示。进一步地，S3中采用Elisa实验检测大鼠血清中甲状腺激素水平变化。进一步地，所述血清中甲状腺激素指标包括FT3、FT4和TSH。进一步地，S3中所述心电图数据通过Powerlab数据分析系统采集。进一步地，S3中将采集的心电图数据与预设指标进行分析时，将大鼠标准Ⅱ导联心电图的QT间期与预设值进行比较，并将获得的心率数据与预设值进行比较。进一步地，所述大鼠模型为甲状腺功能障碍及心脏长QT综合征双表型大鼠模型。与现有技术相比，本专利技术具有以下技术优势：1)本技术方案提供了利用Crisper/Cas9技术对大鼠KCNQ1基因进行全身敲除的方法，其中通过如表1所示的KCNQ1基因的sgRNA序列，可以有效的实现对KCNQ1基因的敲除，成功的构建了一种甲状腺功能障碍及心脏长QT综合征双表型的动物模型。2)本专利技术所构建的全身敲除KCNQ1基因的大鼠模型，证实KCNQ1基因敲除可以能显著降低大鼠甲状腺功能，使大鼠患有轻度甲状腺功能减退症。同时，KCNQ1敲除也会造成大鼠心脏电活动复极化减慢，即长QT综合征。因此，本专利技术证实KCNQ1敲除大鼠是一种甲状腺功能障碍及心脏长QT综合征双表型的动物模型。附图说明图1显示了KCNQ1-sgRNA表达载体结构示意图。图2显示了KCNQ1基因敲除后的测序结果。图3显示了KCNQ1敲除后2月龄大鼠甲状腺功能的变化。其中，图3A显示了KCNQ1基因敲除造成大鼠血清中FT4含量降低。图3B显示了经KCNQ1基因敲除，大鼠血清中FT3的含量有下降的趋势。图3C显示了KCNQ1基因敲除并不影响血清中TSH的水平。图4显示了KCNQ1敲除后9月龄大鼠甲状腺功能的变化。其中，图4A显示了KCNQ1基因敲除造成大鼠血清中FT4含量降低。图4B显示了经KCNQ1基因敲除，大鼠血清中FT3的含量降低。图4C显示了KCNQ1基因敲除并不影响血清中TSH的水平。图5显示了KCNQ1敲除后2月龄大鼠心电图的变化。图6显示了KCNQ1敲除对2月龄大鼠心电图相关参数的影响。其中，图6D显示了KCNQ1基因敲除造成2月龄大鼠标准导联心电图的QT间期延长，即长QT综合征。同时，图6F显示了KCNQ1基因敲除造成2月龄大鼠心率明显减缓。图7显示了KCNQ1敲除后9月龄大鼠心电图的变化。图8显示了KCNQ1敲除对9月龄大鼠心电图相关参数的影响。其中，图8D显示了KCNQ1基因敲除造成9月龄大鼠标准导联心电图的QT间期延长。同时，图8F显示了KCNQ1基因敲除造成9月龄大鼠心率明显减缓。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明。申请人经过广泛而深入地研究，首次发现在全身敲除KCNQ1基因的大鼠中，KCNQ1敲除造成大鼠血清中FT3、FT4含量明显降低，而TSH含量无明显变化，说明KCNQ1敲除大鼠患有轻度甲状腺功能减退症。同时，KCNQ1基因敲除造成大鼠心电图QT间期延长，说明KCNQ1敲除大鼠患有心脏长QT综合征。因此，通过全身敲除KCNQ1基因，成功构建了甲状腺功能障碍及心脏长QT综合征双表型大鼠模型。实施例KCNQ1基因sgRNA表达载体的构建，图1显示了K本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组靶向大鼠KCNQ1基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA包括sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3，其中sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3的靶点特异性序列分别如：SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一组靶向大鼠KCNQ1基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA包括sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3，其中sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3的靶点特异性序列分别如：SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。


2.一种构建甲状腺功能障碍及心脏长QT综合征双表型大鼠模型的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：构建针对大鼠KCNQ1基因的sgRNA，所述sgRNA包括sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3，sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3的靶点特异性序列分别如：SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示；
S2：将S1中所述sgRNA与Cas9核酸酶体外转录成mRNA，之后将所述mRNA注射到大鼠受精卵中，再移植入代孕大鼠，获得F0代大鼠；
S3：对获得的F0代大鼠中尾部基因进行鉴定，对F0代大鼠血清甲状腺激素指标的检测，对F0代大鼠心电图数据进行采集并与预设指标进行分析，获得KCNQ1基因敲除大鼠模型。


3.根据权利要求2所述的一种构建甲状腺功能障碍及心脏长QT综合征双表型大鼠模型的方法，其特征在于，S1中所述sgRNA的构建方式为：利用pCR-BluntII-TOPO作为载体骨架，选择药物筛选抗性为Kanamycin，启动子为U6，构建三条KCNQ1基因的sgRNAs。


4.根据权利要求2所述的一种构建甲状腺功能障碍及心脏长QT综合征双表型大鼠模...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭鲁英，李丽，王康，曹文泽，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：上海;31