用于治疗丙酸血症的基因疗法制造技术

本公开提供了腺相关病毒载体、重组腺相关病毒(rAAV)和它们在治疗丙酸血症(PA)的基因疗法中的使用方法。还提供了包含本发明专利技术的重组腺相关病毒和可药用载体或赋形剂的药物组合物。这些药物组合物可能在治疗由丙酰辅酶A羧化酶α‑亚基(PCCA)中的突变或丙酰辅酶A羧化酶β‑亚基(PCCB)中的突变引起的PA的基因疗法中有用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗丙酸血症的基因疗法与相关申请的交叉引用本申请要求2018年10月1日提交的美国临时专利申请号62/739,471的利益和优先权，所述临时申请的全部公开内容为所有目的整体通过参考并入本文。序列表本申请含有以ASCII格式电子提交并整体通过参考并入本文的序列表。所述2019年9月22日生成的ASCII副本名为ULP-001WO_SL_ST25.txt，大小为98,889字节。
本公开总的来说涉及腺相关病毒载体、腺相关病毒以及它们在用于治疗丙酸血症的基因疗法中的使用方法。
技术介绍
丙酸血症(PA)，又称丙酸尿，是由有活性的丙酰辅酶A羧化酶(PCC)的缺乏引起的一种有机酸代谢的先天性错误，所述酶为丙酰辅酶A转化为(D)-甲基丙二酰辅酶A所需，这是奇数链脂肪酸和产丙酸氨基酸、特别是异亮氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸分解代谢途径中的关键步骤。PCC酶由两个不同的亚基α和β组成，它们分别由PCCA和PCCB基因编码。丙酰辅酶A羧化酶缺陷可以由PCCA或PCCB任一者中的突变引起。在一项研究中，对30位PA患者进行了突变分析，发现15位患者具有α-亚基缺乏，并且15位患者具有β-亚基缺乏。参见Yang等，2004,MolGenetandMetab.81:335-342。在美国，PA的估计发病率是1:105,000至1:130,000。这种罕见的常染色体隐性代谢障碍在新生儿早期表现为进食不良、呕吐、嗜睡、癫痫发作和缺乏肌肉张力。如果不治疗，由于继发性高氨血症、感染、心肌病或基底节性中风，死亡可能迅速发生。PA在新生儿中可以几乎立即被诊断出来，并且在美国所述疾病被包括在新生儿筛查疾病组中。目前，PA通过氨基酸前体的饮食限制、补充L-肉碱以解决肉碱水平降低问题以及施用抗生素以降低肠道细菌的丙酸产量进行管控。在患者无法通过标准治疗来管控的情况下，肝移植在PA的管控中发挥作用。然而，尽管通过营养、辅因子和抗生素疗法的复杂组合进行了应对所述疾病的积极尝试，但PA患者的长期预后仍然不良。参见vanderMeer等，1996,Eur.J.Pediatr.155:205-210。因此，需要解决所述疾病的根本原因即PCC的缺乏的改进的治疗方法。本专利技术通过产生介导功能性PCCA或PCCB基因向PA患者的转移的腺相关病毒载体来应对这种需求。本专利技术还描述了将功能性PCCA或PCCB基因递送到PA患者的重组腺相关病毒(rAAV)的产生。
技术实现思路
本专利技术提供了组合物和它们在基因疗法中的使用方法。更具体来说，本文中提供了可用于治疗PA的包含腺相关病毒(AAV)衣壳和包装在其中的载体基因组的重组腺相关病毒(rAAV)。一方面，本公开提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)，其包含AAV衣壳和包装在其中的载体基因组，所述载体基因组以5’至3’的顺序包含：(a)5’-反向末端重复序列(5’-ITR)序列；(b)启动子序列；(c)PCCA的部分或完整编码序列；和(d)3’-反向末端重复序列(3’-ITR)序列。另一方面，本公开提供了一种rAAV，其包含AAV衣壳和包装在其中的载体基因组，作为可操作连接的组件所述载体基因组以5’至3’的顺序包含：(a)5’-ITR序列；(b)增强子序列；(c)启动子序列；(d)内含子序列；(e)PCCA的部分或完整编码序列；(f)多聚腺苷酸化信号序列；和(g)3’-ITR序列。在某些实施方式中，本公开提供了一种rAAV，其包含AAV衣壳和包装在其中的载体基因组，所述载体基因组包含AAV5’-ITR序列、启动子序列、PCCA或其同型或其功能性片段或功能性变体的部分或完整编码序列和AAV3’-ITR序列。在某些实施方式中，本公开提供了一种rAAV，其包含AAV衣壳和包装在其中的载体基因组，所述载体基因组包含AAV5’-ITR、启动子序列、人类PCCA5’-非翻译区(5’-UTR)的截短或完整的核苷酸序列、PCCA或其同型或其功能性片段或功能性变体的部分或完整编码序列、截短或完整的人类PCCA3’-非翻译区(3’-UTR)核苷酸序列和AAV3’-ITR。在某些实施方式中，本公开提供了一种rAAV，其包含AAV衣壳和包装在其中的载体基因组，所述载体基因组包含由SEQIDNO：30表示的完整的人类PCCA5’-UTR。在某些实施方式中，所述包装的基因组包含截短的人类PCCA5’-UTR核苷酸序列。在某些实施方式中，所述人类PCCA5’-UTR的截短的核苷酸序列包含SEQIDNO：30的一部分。在某些实施方式中，所述人类PCCA5’-UTR的截短的核苷酸序列包含与SEQIDNO：30的等长度区域至少95％同一性的至少100个连续核苷酸的核苷酸序列。在某些实施方式中，当所述包装的载体基因组中的部分或完整编码序列是针对PCCA时，所述截短或完整的人类PCCA5’-UTR位于所述内含子序列与PCCA的部分或完整编码序列之间。在某些实施方式中，所述包装的载体基因组包含由SEQIDNO：31表示的完整的人类PCCA3’-UTR。在某些实施方式中，所述包装的基因组包含截短的人类PCCA3’-UTR核苷酸序列。在某些实施方式中，所述人类PCCA3’-UTR的截短的核苷酸序列包含SEQIDNO：31的一部分。在某些实施方式中，所述人类PCCA3’-UTR的截短的核苷酸序列包含与SEQIDNO：31的等长度区域至少95％同一性的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列。在某些实施方式中，当所述包装的载体基因组中的部分或完整编码序列是针对PCCA时，所述截短或完整的人类PCCA3’-UTR位于所述多聚腺苷酸化信号序列与3’-ITR序列之间。在一个实施方式中，所述PCCA的部分或完整编码序列是野生型编码序列。在可选实施方式中，所述PCCA的部分或完整编码序列是密码子优化的编码序列。在一个示例性实施方式中，所述PCCA的部分或完整编码序列为了在人类中表达而被密码子优化。在某些实施方式中，PCCA由SEQIDNO：1中示出的野生型编码序列编码。在另一个实施方式中，可以使用表达PCCA的天然同型或变体的编码序列，例如在UniProtKB/Swiss-Prot登记号P05165-1(SEQIDNO：25)、P05165-2(SEQIDNO：26)和P05165-3(SEQIDNO：27)中示出的。在某些实施方式中，PCCA由密码子优化的编码序列编码。在某些实施方式中，PCCA由与SEQIDNO：1中示出的野生型编码序列具有少于80％同一性的密码子优化的编码序列编码。在某些示例性实施方式中，PCCA由选自SEQIDNOs：2-6的密码子优化的编码序列编码。在某些实施方式中，PCCA由与选自SEQIDNOs：2-6的序列至少80％同一性的密码子优化的编码序列编码。在某些实施方式中，PCCA由与选自SEQIDNOs：2-6的序列至少90％同一性的密码子优化的编码序列编码。在某些实施方式中，PCCA由与选自SEQIDNOs：2-6的序列至少95％同一性的密码子优化的编码序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV包含AAV衣壳和包装在其中的载体基因组，所述载体基因组以5’至3’的顺序包含：/n(a)5’-反向末端重复序列(5’-ITR)序列；/n(b)启动子序列；/n(c)PCCA或PCCB的部分或完整编码序列；和/n(d)3’-反向末端重复序列(3’-ITR)序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181001 US 62/739,4711.一种重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV包含AAV衣壳和包装在其中的载体基因组，所述载体基因组以5’至3’的顺序包含：
(a)5’-反向末端重复序列(5’-ITR)序列；
(b)启动子序列；
(c)PCCA或PCCB的部分或完整编码序列；和
(d)3’-反向末端重复序列(3’-ITR)序列。


2.根据权利要求1所述的rAAV，其中所述AAV衣壳来自于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、rh10或hu37的AAV。


3.根据权利要求2所述的rAAV，其中所述AAV衣壳来自于AAV9。


4.根据权利要求2所述的rAAV，其中所述AAV衣壳来自于AAV8。


5.根据权利要求1所述的rAAV，其中所述AAV衣壳是AAV9变体衣壳。


6.根据权利要求1-5中的任一项所述的rAAV，其中所述启动子选自鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、甲状腺素运载蛋白(TTR)启动子、甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、α-1抗胰蛋白酶因子(A1AT)启动子、CAG启动子、PCCA基因特异性内源启动子和PCCB基因特异性内源启动子。


7.根据权利要求6所述的rAAV，其中当所述载体基因组中的部分或完整编码序列是针对PCCA时，所述启动子是PCCA基因特异性内源启动子，其包含与SEQIDNO：34的等长度区域至少95％同一性的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列。


8.根据权利要求6所述的rAAV，其中当所述载体基因组中的部分或完整编码序列是针对PCCB时，所述启动子是PCCB基因特异性内源启动子，其包含与SEQIDNO：36的等长度区域至少95％同一性的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列。


9.根据权利要求6所述的rAAV，其中所述启动子是CBA启动子。


10.根据权利要求1-9中的任一项所述的rAAV，其中所述5’-ITR和/或3’-ITR序列来自于AAV2。


11.根据权利要求10所述的rAAV，其中所述5’-ITR序列和3’-ITR序列包含SEQIDNO：15或由其构成。


12.根据权利要求1-9中的任一项所述的rAAV，其中所述5’-ITR序列和/或3’-ITR序列来自于非AAV2来源。


13.根据权利要求1-7和9-12中的任一项所述的rAAV，其中所述PCCA的部分或完整编码序列是野生型编码序列。


14.根据权利要求13所述的rAAV，其中所述PCCA的编码序列包含SEQIDNO：1。


15.根据权利要求1-7和9-12中的任一项所述的rAAV，其中所述PCCA的部分或完整编码序列是密码子优化的编码序列。


16.根据权利要求15所述的rAAV，其中所述PCCA的编码序列包含选自SEQIDNOs：2-6的编码序列。


17.根据权利要求1-6和8-12中的任一项所述的rAAV，其中所述PCCB的部分或完整编码序列是野生型编码序列。


18.根据权利要求17所述的rAAV，其中所述PCCB的编码序列包含SEQIDNO：7。


19.根据权利要求1-6和8-12中的任一项所述的rAAV，其中所述PCCB的部分或完整编码序列是密码子优化的编码序列。


20.根据权利要求19所述的rAAV，其中所述PCCB的编码序列包含选自SEQIDNOs：8-12的编码序列。


21.根据权利要求1-7和9-16中的任一项所述的rAAV，其中所述包装的基因组还包含人类PCCA5’-非翻译区(UTR)和/或3’-UTR的截短或完整的核苷酸序列。


22.根据权利要求21所述的rAAV，其中所述人类PCCA5’-UTR的完整的核苷酸序列包含SEQIDNO：30。


23.根据权利要求21所述的rAAV，其中所述人类PCCA5’-UTR得截短的核苷酸序列包含与SEQIDNO：30的等长度区域至少95％同一性的至少100个连续核苷酸的核苷酸序列。


24.根据权利要求21所述的rAAV，其中所述人类PCCA3’-UTR的完整的核苷酸序列包含SEQIDNO：31。


25.根据权利要求21所述的rAAV，其中所述人类PCCA3’-UTR的截短的核苷酸序列包含与SEQIDNO：31的等长度区域至少95％同一性的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列。


26.根据权利要求1-6、8-12和17-20中的任一项所述的rAAV，其中所述包装的基因组还包含人类PCCB5’-非翻译区(UTR)和/或3’-UTR的截短或完整的核苷酸序列。


27.根据权利要求26所述的rAAV，其中所述人类PCCB5’-UTR的完整的核苷酸序列包含SEQIDNO：32。


28.根据权利要求26所述的rAAV，其中所述人类PCCB5’-UTR的截短的核苷酸序列包含与SEQIDNO：32的等长度区域至少95％同一性的至少100个连续核苷酸的核苷酸序列。


29.根据权利要求26所述的rAAV，其中所述人类PCCB3’-UTR的完整的核苷酸序列包含SEQIDNO：33。


30.根据权利要求26所述的rAAV，其中所述人类PCCB3’-UTR的截短的核苷酸序列包含与SEQIDNO：33的等长度区域至少95％同一性的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列。


31.根据权利要求1-30中的任一项所述的rAAV，其中所述包装的基因组还包含多聚腺苷酸化信号序列。


32.根据权利要求31所述的rAAV，其中所述多聚腺苷酸化信号序列选自牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸化信号序列、SV40多聚腺苷酸化信号序列、兔β珠蛋白多聚腺苷酸化信号序列、PCCA基因特异性内源多聚腺苷酸化信号序列、PCCB基因特异性内源多聚腺苷酸化信号序列。


33.根据权利要求32所述的rAAV，其中所述多聚腺苷酸化信号序列是牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸化信号序列或SV40多聚腺苷酸化信号序列。


34.根据权利要求33所述的rAAV，其中所述多聚腺苷酸化信号序列包含SEQIDNO：22或由其构成。


35.根据权利要求33所述的rAAV，其中所述多聚腺苷酸化信号序列包含SEQIDNO：23或由其构成。


36.根据权利要求1-7、9-16、21-25和31-32中的任一项所述的rAAV，其中当所述载体基因组中的部分或完整编码序列是针对PCCA时，所述多聚腺苷酸化信号序列包含PCCA基因特异性内源多聚腺苷酸化信号序列。


37.根据权利要求36所述的rAAV，其中所述PCCA基因特异性内源多聚腺苷酸化信号序列包含与SEQIDNO：35的等长度区域至少95％同一性的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列。


38.根据权利要求1-6、8-12、17-20和26-32中的任一项所述的rAAV，其中当所述载体基因组中的部分或完整编码序列是针对PCCB时，所述多聚腺苷酸化信号序列包含PCCB基因特异性内源多聚腺苷酸化信号序列。


39.根据权利要求38所述的rAAV，其中所述PCCB基因特异性内源多聚腺苷酸化信号序列包含与SEQIDNO：37的等长度区域至少95％同一性的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列。


40.根据权利要求1-39中的任一项所述的rAAV，其中所述包装的基因组还包含一个或多个增强子序列。


41.根据权利要求40所述的rAAV，其中所述增强子选自巨细胞病毒(CMV)立即早期基因增强子、甲状腺素运载蛋白增强子(enTTR)、鸡β-肌动蛋白(CBA)增强子、En34增强子和载脂蛋白E(ApoE)增强子。


42.根据权利要求41所述的rAAV，其中所述增强子是CMV增强子。


43.根据权利要求42所述的rAAV，其中所述增强子包含SEQIDNO：19或由其构成。


44.根据权利要求40-43所述的rAAV，其中所述增强子位于所述启动子序列上游。


45.根据权利要求1-44中的任一项所述的rAAV，其中所述包装的基因组还包含一个或多个内含子序列。


46.根据权利要求45所述的rAAV，其中所述内含子选自SV40小T内含子、兔血红蛋白亚基β(rHBB)内含子、人类β珠蛋白IVS2内含子、Promega嵌合内含子和hFIX内含子。


47.根据权利要求46所述的rAAV，其中所述内含子是SV40小T内含子或rHBB内含子。


48.根据权利要求47所述的rAAV，其中所述内含子包含SEQIDNO：20或由其构成。


49.根据权利要求47所述的rAAV，其中所述内含子包含SEQIDNO：21或由其构成。


50.一种重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV包含AAV衣壳和包装在其中的载体基因组，作为可操作连接的组件所述载体基因组以5’至3’的顺序包含：
(a)5’-ITR序列；
(b)增强子序列；
(c)启动子序列；
(d)内含子序列；
(e)PCCA或PCCB的部分或完整编码序列；
(f)多聚腺苷酸化信号序列；和
(g)3’-ITR序列。


51.根据权利要求50所述的rAAV，其中所述AAV衣壳来自于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、rh10或hu37的AAV。


52.根据权利要求51所述的rAAV，其中所述AAV衣壳来自于AAV8或AAV9。


53.根据权利要求50所述的rAAV，其中所述AAV衣壳是AAV9变体衣壳。


54.根据权利要求50-53中的任一项所述的rAAV，其中所述启动子选自鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、甲状腺素运载蛋白(TTR)启动子、甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、α-1抗胰蛋白酶因子(A1AT)启动子、CAG启动子、PCCA基因特异性内源启动子和PCCB基因特异性内源启动子。


55.根据权利要求54所述的rAAV，其中当所述载体基因组中的部分或完整编码序列是针对PCCA时，所述启动子是PCCA基因特异性内源启动子，其包含与SEQIDNO：34的等长度区域至少95％同一性的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列。


56.根据权利要求54所述的rAAV，其中当所述载体基因组中的部分或完整编码序列是针对PCCB时，所述启动子是PCCB基因特异性内源启动子，其包含与SEQIDNO：36的等长度区域至少95％同一性的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列。


57.根据权利要求54所述的rAAV，其中所述启动子是CBA启动子。


58.根据权利要求50-57中的任一项所述的rAAV，其中所述5’-ITR和/或3’-ITR序列来自于AAV2。


59.根据权利要求58所述的rAAV，其中所述5’-ITR序列和3’-ITR序列包含SEQIDNO：15或由其构成。


60.根据权利要求50-57中的任一项所述的rAAV，其中所述5’-ITR序列和/或3’-ITR序列来自于非AAV2来源。


61.根据权利要求50-55和57-60中的任一项所述的rAAV，其中所述PCCA的部分或完整编码序列是野生型编码序列。


62.根据权利要求61所述的rAAV，其中所述PCCA的编码序列包含SEQIDNO：1。


63.根据权利要求50-55和57-60中的任一项所述的rAAV，其中所述PCCA的部分或完整编码序列是密码子优化的编码序列。


64.根据权利要求63所述的rAAV，其中所述PCCA的编码序列包含选自SEQIDNOs：2-6的编码序列。


65.根据权利要求50-54和56-60中的任一项所述的rAAV，其中所述PCCB的部分或完整编码序列是野生型编码序列。


66.根据权利要求65所述的rAAV，其中所述PCCB的编码序列包含SEQIDNO：7。


67.根据权利要求50-54和56-60中的任一项所述的rAAV，其中所述PCCB的部分或完整编码序列是密码子优化的编码序列。


68.根据权利要求67所述的rAAV，其中所述PCCB的编码序列包含选自SEQIDNOs：8-12的编码序列。


69.根据权利要求50-68中的任一项所述的rAAV，其中所述多聚腺苷酸化信号序列选自牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸化信号序列、SV40多聚腺苷酸化信号序列、兔β珠蛋白多聚腺苷酸化信号序列、PCCA基因特异性内源多聚腺苷酸化信号序列、PCCB基因特异性内源多聚腺苷酸化信号序列。


70.根据权利要求69所述的rAAV，其中所述多聚腺苷酸化信号序列是牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸化信号序列或SV40多聚腺苷酸化信号序列。


71.根据权利要求70所述的rAAV，其中所述多聚腺苷酸化信号序列包含SEQIDNO：22或由其构成。


72.根据权利要求70所述的rAAV，其中所述多聚腺苷酸化信号序列包含SEQIDNO：23或由其构成。


73.根据权利要求50-55、57-64和69中的任一项所述的rAAV，其中当所述载体基因组中的部分或完整编码序列是针对PCCA时，所述多聚腺苷酸化信号序列是PCCA基因特异性内源多聚腺苷酸化信号序列。


74.根据权利要求73所述的rAAV，其中所述PCCA基因特异性内源多聚腺苷酸化信号序列包含与SEQIDNO：35的等长度区域至少95％同一性的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列。


75.根据权利要求50-54、56-60和65-69中的任一项所述的rAAV，其中当所述载体基因组中的部分或完整编码序列是针对PCCB时，所述多聚腺苷酸化信号序列是PCCB基因特异性内源多聚腺苷酸化信号序列。


76.根据权利要求75所述的rAAV，其中所述PCCB基因特异性内源多聚腺苷酸化信号序列包含与SEQIDNO：37的等长度区域至少95％同一性的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列。


77.根据权利要求50-76中的任一项所述的rAAV，其中所述增强子选自巨细胞病毒立即早期基因(CMV)增强子、甲状腺素运载蛋白增强子(enTTR)、鸡β-肌动蛋白(CBA)增强子、En34增强子和ApoE增强子。


78.根据权利要求77所述的rAAV，其中所述增强子是CMV增强子。


79.根据权利要求50-78中的任一项所述的rAAV，其中所述内含子选自SV40小T内...

【专利技术属性】
技术研发人员：马修·斯科特·福勒，塞缪尔·沃兹沃斯，凯利里德·克拉克，肖恩·克里斯托弗·多尔蒂，斯图尔特·克雷格，
申请(专利权)人：奥特吉尼克斯制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US