一种从植物甾醇制备脱氧胆酸的方法技术

本发明专利技术提供了保藏编号为CCTCC NO：M 2020987的诱变菌种在制备脱氧胆酸中的应用。本发明专利技术提供了一种新的以植物甾醇为原料，通过生物发酵与化学合成相结合的手段，制备脱氧胆酸的方法，该方法未使用动物源提取，可以以工业废水废渣为原料，绿色环保；通过分支杆菌Mycobacterium sp.NRRL B‑3805诱变菌种生物发酵的方法在植物甾醇侧链一步构建胆酸类化合物的羰基侧链，操作简单，收率高，异构体杂质少，有机溶剂使用量少；通过本发明专利技术制备脱氧胆酸类化合物，反应试剂简单易得，反应条件温和，反应收率高，适合工业化大生产。

【技术实现步骤摘要】
一种从植物甾醇制备脱氧胆酸的方法
本专利技术涉及化学制药
，尤其涉及一种从植物甾醇制备脱氧胆酸的方法，具体涉及一种以植物甾醇为原料通过生物发酵与化学合成相结合的方式制备脱氧胆酸化合物的方法。
技术介绍
脱氧胆酸(DeoxycholicAcid，简称DCA)又名去氧胆酸，化学名称为3α，12α-二羟-5β-胆烷酸，是胆酸失去一个氧原子而得的一种游离胆汁酸，在胆汁中主要以牛磺酸、甘氨酸结合形式存在。脱氧胆酸及其盐有表面活性，为化妆品和药剂中安全有效的乳化剂，有抗真菌和抗炎作用，可用于治疗牙根患疾。在皮肤外科中可用于皮脂腺分泌过多症的治疗。在香粉等制品中应用可除去多余皮脂和汗渍，而不使皮肤有干燥感。有研究显示，注入脂肪组织的脱氧胆酸盐经由细胞溶解机理降解脂肪细胞。由于注入脂肪的脱氧胆酸盐因暴露于蛋白质而快速失活，接着快速返回到肠内容物，所以其作用受空间限制。作为赋予临床安全性的此减弱作用的结果，脂肪去除疗法通常需要4-6疗程。此无需外科手术的局部脂肪去除不仅有利于与病理学局部脂肪沉积(例如HIV治疗中的医学介入易发的血脂异常)相关的治疗性处理，而且有利于美容脂肪去除且无外科手术(例如吸脂术)所固有的伴随风险。在美国，DCA已被FDA批准用于减少颏下中度至重度脂肪。目前脱氧胆酸的制备方法主要有两种，一种是从生物体提取分离出来，但从动物来源获得的脱氧胆酸可能含有病原体；另一种是采用合成的方法获得脱氧胆酸，现有的合成方法工艺复杂，对环境污染，成本相对较高。近年来，有从植物甾醇为原料合成脱氧胆酸的相关报道，专利CN106146594A报道了以豆甾醇和麦角固醇为原料合成DCA的方法，该方法采用全合成方法，存在反应步骤长，收率低，试剂昂贵等问题，不适合工业化生产。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种从植物甾醇制备脱氧胆酸的方法，操作简单，收率高。为达到上述目的，本专利技术提供了保藏编号为CCTCCNO：M2020987的诱变菌种在制备脱氧胆酸中的应用。本专利技术还提供了保藏编号为CCTCCNO：M2020987的诱变菌种联合赭曲霉菌AspergillusochraceusATCC18500菌种在制备脱氧胆酸中的应用。所述赭曲霉菌AspergillusochraceusATCC18500菌种的来源为美国模式菌种收集中心(ATCC)。本专利技术还提供了保藏编号为CCTCCNO：M2020987的诱变菌种联合保藏编号为CCTCCNO:M2013544的耻垢分枝杆菌MycobacteriumsmegmatisNK-XHX-118菌种在制备脱氧胆酸中的应用。上述保藏编号为CCTCCNO：M2020987的诱变菌种为分支杆菌Mycobacteriumsp.NRRLB-3805的诱变菌种。上述诱变菌种由分支杆菌NRRLB-3805为出发菌种，经诱变得到。上述原始菌种分支杆菌NRRLB-3805的来源为美国农业研究菌种保藏中心(NRRL)。本专利技术提供了用于生产4-胆烯酸-3-酮的分支杆菌诱变菌种的诱变方法，包括以下步骤：以分支杆菌NRRLB-3805为出发菌种，经过斜面培养和二级种子培养，收集菌体制备菌悬液，加入亚硝基胍进行诱变处理，将诱变后的菌悬液稀释后涂布于固体平板培养基上，挑选单菌落进行植物甾醇发酵，检测4-胆烯酸-3-酮的产量，得到能产生4-胆烯酸-3-酮的目标诱变菌种，并分离保存菌株。本专利技术优选的，所述斜面培养的培养基配方为：酵母膏粉10～20g/L，更优选10g/L；葡萄糖15～30g/L，更优选15g/L；硝酸钠2～6g/L，更优选5.4g/L；磷酸氢二铵0.1～1g/L，更优选0.6g/L；琼脂粉20g/L,pH＝7.5。本专利技术优选的，所述种子培养的培养基配方为：酵母膏粉10～20g/L，更优选10g/L；葡萄糖15～30g/L，更优选15g/L；硝酸钠2～6g/L，更优选5.4g/L；磷酸氢二铵0.1～1g/L，更优选0.6g/L，pH＝7.5。本专利技术优选的，所述固体培养基的配方为：酵母膏粉10～20g/L，更优选10g/L，葡萄糖15～30g/L，更优选15g/L；硝酸钠2～6g/L，更优选5.4g/L；磷酸氢二铵0.1～1g/L，更优选0.6g/L；琼脂粉20g/L，pH＝7.5。所述诱变处理的时间优选为30min。具体的，本专利技术提供了一种从植物甾醇制备脱氧胆酸的方法，包括以下步骤：A)将保藏编号为CCTCCNO：M2020987的诱变菌种经培养后接种至第一转化培养基，对式Ⅰ所示植物甾醇进行第一发酵转化，得到化合物1；B)将赭曲霉菌AspergillusochraceusATCC18500菌种经第二斜面培养、第二种子培养后接种至第二转化培养基，对化合物1进行第二发酵转化，得到化合物2；或将保藏编号为CCTCCNO:M2013544的耻垢分枝杆菌MycobacteriumsmegmatisNK-XHX-118菌种经第三种子培养后接种至第三转化培养基，对化合物1进行第三发酵转化，得到化合物2’；C)化合物2或化合物2’在乙酸酐和浓硫酸的作用下反应生成化合物3；D)化合物3在催化剂作用下与空气反应生成化合物4；E)化合物4在催化剂的作用下与氢气反应生成化合物5；F)化合物5溶于四氢呋喃和水中，与硼氢化钠反应生成式Ⅱ所示脱氧胆酸；其中，R为-(CH2)3CH(C2H5)CH(CH3)2、-CH2CH＝CHCH(C2H5)CH(CH3)2、-(CH2)3CH(CH3)CH(CH3)2或-CH2CH＝CHCH(CH3)CH(CH3)2。上述反应的路线如下：路线一：本申请以植物甾醇为原料，通过生物发酵与化学合成相结合的手段，制备脱氧胆酸化合物。从原料来源来说，与动物源原料相比，植物甾醇广泛存在于植物的根茎叶及果实中，在大自然中储量惊人，并且现代商业产品的生产中的废渣都含有高含量的植物甾醇，如油脂产业中压榨后的残渣或馏出物，制糖业中的甜菜渣和甘蔗渣，还有造纸的废液废水中均含有一定含量的植物甾醇，如果对这些甾醇进行开发利用，不仅避免了动物源病原体风险，更是解决了废水废渣的环保问题。从技术手段来讲，本专利技术采用微生物发酵与化学合成相结合的方法合成脱氧胆酸，在脱氧胆酸合成的2个关键步骤侧链构建和9或11位α羟基引入均采用微生物转化法，具有操作简单，收率高，异构体杂质少，有机溶剂使用量少等优势。本专利技术优选的，所述第一发酵转化方法具体为：将保藏编号为CCTCCNO：M2020987的诱变菌种经一级种子培养和二级种子培养后加入转化培养基中，接种量10％～40％，温度20-30℃，转速200～600rpm，空气流量0.1～0.4Nm3/h，压力0.01～0.1MPa，转化时间为72～180h。本专利技术优选的，所述一级种子培养和二级种子培养的培养基配方为：酵母膏粉10～20g/L，葡萄糖10～20g/L,硝酸钠本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.保藏编号为CCTCC NO：M 2020987的诱变菌种在制备脱氧胆酸中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.保藏编号为CCTCCNO：M2020987的诱变菌种在制备脱氧胆酸中的应用。


2.保藏编号为CCTCCNO：M2020987的诱变菌种联合赭曲霉菌AspergillusochraceusATCC18500菌种在制备脱氧胆酸中的应用。


3.保藏编号为CCTCCNO：M2020987的诱变菌种联合保藏编号为CCTCCNO:M2013544的耻垢分枝杆菌MycobacteriumsmegmatisNK-XHX-118菌种在制备脱氧胆酸中的应用。


4.一种从植物甾醇制备脱氧胆酸的方法，包括以下步骤：
A)将保藏编号为CCTCCNO：M2020987的诱变菌种经培养后接种至第一转化培养基，对式Ⅰ所示植物甾醇进行第一发酵转化，得到化合物1；
B)将赭曲霉菌AspergillusochraceusATCC18500菌种经第二斜面培养、第二种子培养后接种至第二转化培养基，对化合物1进行第二发酵转化，得到化合物2；
或将保藏编号为CCTCCNO:M2013544的耻垢分枝杆菌MycobacteriumsmegmatisNK-XHX-118菌种经第三种子培养后接种至第三转化培养基，对化合物1进行第三发酵转化，得到化合物2’；
C)化合物2或化合物2’在乙酸酐和浓硫酸的作用下反应生成化合物3；
D)化合物3在催化剂作用下与空气反应生成化合物4；
E)化合物4在催化剂的作用下与氢气反应生成化合物5；
F)化合物5溶于四氢呋喃和水中，与硼氢化钠反应生成式Ⅱ所示脱氧胆酸；






其中，R为-(CH2)3CH(C2H5)CH(CH3)2、-CH2CH＝CHCH(C2H5)CH(CH3)2、-(CH2)3CH(CH3)CH(CH3)2或-CH2CH＝CHCH(CH3)CH(CH3)2。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一发酵转化方法为：将保藏编号为CCTCCNO：M2020987的诱变菌种经一级种子培养和二级种子培养后加入转化培养基中，接种量10％～40％，温度20-30℃，转速200～600rpm，空气流量0.1～0.4Nm3/h，压力0.01～0.1MPa，转化时间为72～180h。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述一级种子培养和二级种子培养的培养基配方为：酵母膏粉10～20g/L，葡萄糖10～20g/L,硝酸钠2～6g/L，磷酸氢二铵0.1～1.0g/L，pH为7.5；
所述转化培养基配方为：植物甾醇10～...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋红平，唐杰，李斌，郭志军，
申请(专利权)人：湖南醇康医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43